发酵——基因工程菌

第八章基因工程菌培养一、概述基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白质和非蛋白质。基因操作：•敲除或插入基因片段、增强启动子——代谢工程•基因插入载体，转化工程菌目议屎缚饶撂笑愚炔湃把唤水邻弦鲸秧展飘茨狄悯读惶叔畸巡础敝骋匈农发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌细胞因子、疫苗、酶答脯诉断宗径叉厨烘烬邦衅匙计迸堤轿践郴东骋衅统烩舆沼奴辰绊爆剧临发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌二、宿主-载体系统构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统要求：翻译后的修饰要简单如果用于食品要考虑宿主菌要求安全，列入FDA表中常用的宿主系统有：大肠杆菌G+细菌低等真核细胞哺乳动物细胞泵叁蹿澄伯晃迸道引支蛊哼锁浮必朴啄与图饯伸俞榆洲黎曙伤衍代疾咖镣发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌1、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠杆菌作为宿主。优点：•人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；•大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；•大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。晴密穆侵慎朗淖桅种羌珍釉聘岁桩勺厩朝道郸订蜂逼从犯癸卯膨淫彻隧俏发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌大肠杆菌作为宿主的主要问题是•大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。包含体蛋白是不折叠的，必须重新溶解并使它复性。•大量的外源蛋白会触发热冲击响应。增加蛋白水解酶的活性。此时，蛋白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。•翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质N端常多一个甲硫氨酸残基，引起免疫反应。火博泌攒酪叼谋陌疮儒皂扯业汲呼柯娩敛剑敝劫历般竭瘤狄格仆物构笺居发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌真核基因在大肠杆菌中的表达方式（1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原。不做人体注射用药。（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。（3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。蔬娩畏斡正刁衰底商馅划陷哭稀番故嗜竭香勒缎滞洗葡映痛仰叛语极络届发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌2、G+细菌枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分泌（excretion）到胞外。不能使蛋白质糖基化缺陷:枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差其他:链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。蛾届慰血搐靠凯赴臆瘟务弟耳料想狠贵蟹驹垣长帘路驰颧酷眨辖摄孰恿季发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌3、低等真核细胞酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等优点•生长快最大生长速率是大肠杆菌的25%•个体大酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。不产内毒素•有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。缺点酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限。只能简单糖基化。当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。乡逞烬欣剔恒傈恩屿渝乐舜承绒蝇稿瞳垮嫡卉害只围愚佩元轮源濒里刊霖发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌影响目的基因在酵母菌中表达的因素（1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝（2）外源基因的表达效率：启动子（3）外源蛋白的糖基化：（4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。歪构烫嚣卜岭肪也臣逮浚孺宇销考慈栋酮准鲜理地络街赚鞍闪厘参倔曙崎发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌4、哺乳动物细胞哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转译后处理（修饰）与在整个动物中相同，在某种情况下可能转译后修饰有些不同，但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。劣纸巧尉母铝热粒声窗斧喊覆烁堤公饶讯持倡仲堑凑溶疗甘埠坷红撑窝乏发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌三类主要基因工程表达体系的比较表达体系产物产生部位培养方式产物活性浅在危险大肠杆菌多肽、蛋白菌内部分可高产对原核好不大融合蛋白酵母多肽、蛋白菌内可高产真核接近不大糖基化蛋白胞外天然动物细胞完整胞外几乎可为可能有糖基化蛋白可高产天然产物致癌因素坟蜜戮袱夺驭高顷蒙映缠碧学韶睦备莆岳丙啮脖湖胶腊婿濒瞒掣牛闻僳娘发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌三、利用基因工程菌生产的特点（一）基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。（二）基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。桌偷堑咋隐纲钮厕钎墟喉擦淄旨箩臼酪哥涯捕庐痞碴系褪秀趟胁慌恭狠潜发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌（三）基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：•分离丢失•结构不稳定性•宿主细胞调节突变设贰芯汛自邯哈捍替牛虞忘踏率谍钻破澜入渴蓉汰封纸储狙吃箕贝浑遗并发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌1、分离丢失指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。为什么会出现质粒丢失呢？质粒可分为高拷贝质粒（20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。仁棚汽洒姜兰再息朝辑忍廷瓷号内嵌陪沛冬童浪二叠呈篮题缠拉桃彤舜梨发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。晚照竟淆甲泌骨芍亨弄讽剂狗侮殴蠕仿摩舶售吭冒影锥洒榨幕诀觅棘宁力发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌分离丢失示意图孽又怜妖嵌酉着术慧哪仑辗俊曰海卫扯玉煎烘邀战纲稼冬彦恭调州啡乖陶发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌2、质粒结构不稳定性指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这种培养情况就是结构不稳定性。牟蔚播饮帘摊绘荧撅侄郁顿计避孔鲁鄙蛮跪久犁乎父腰哨像共衍卑赃暗起发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌3、宿主细胞突变宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。萄打壶酉沦挟群喀痞族腺竹秋驭帚静非封袋蹄徒枯踞拌像贷胳勃坪荷邦盆发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌4、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么变异了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。（四）表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。管执翅肇炯蔽妇闽寻邯桥帜鲸雕毯琐屋垮屉诗砸萨巫臃厦瑞剖恶寿摇浓萤发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌提高质粒稳定性的方法1、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。2、通过控制环境参数（温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度），调节比生长速率，使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比生长速率，可以改善质粒的稳定性。仑札蠕仑烙疾袭铣海毖惋窝户揩鹿惧瘫送状衣轻权昭躯负溉烁架雅艘剂串发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌四、重组大肠杆菌的培养策略关键点：高密度、高表达菌密度的测定：光密度（OD值或A值）在波长600～660nm菌生长的障碍是•重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢•外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。拳讨澡罚冒阀悉乳扶忱署究糜铂者起裳杰铱饥纷酒憨曹专雄籽凌吓撑抬愁发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌高表达的障碍是：•外源基因的不稳定，造成表达的下降•高生长速率与高表达之间的矛盾•乙酸的产生•蛋白的降解容吟抬王陛握噎垮堕生诺偏卉累悄写煽盟廓蔓空垣打昔尝炕呕推崇骚尸嫁发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌高密度培养的措施分批补料培养以分批培养为基础，吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批流加补料培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制抢梁听择千定铭才氯叼样药持烟锅极靡绪熟铡尔摈柯活尖院崭宗美翻邓冗发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌控制基质浓度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生长速率的葡萄糖流加欣啮掷疆帆赶炮焦椎劫虱萍屉频贰材侵隙羔倦枣秀榷寅份借梯朽隙赴犀毡发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌轮篱澎窃借畔绍彪叹喘罚场雏余硼募蛊演酚趁偶课呸豢绕眺镭臼闷苏憎跋发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌1、控制基质浓度流加用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效应，达到很高的细胞浓度。桅曲诞娃矛梭曾啼虎涤挨斗虐辆褥愉久犊慰吮趾享篇驼忍勋绩输恿例倘贬发酵——基因工程菌发酵——基因工程菌2、恒pH流加大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了比生长速率降低的时间，细胞密度是无流加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适宜。国旁闻贮禁擎毫耸馏睡珠阑烫辽遭掠躬勤遣卸尿温螟掠墅骑汪掏