细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍

1/3细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。二、荧光染色法原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细2/3胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。《荧光染色法支原体检测试剂盒》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的荧光染色法支原体检测方法进行操作。三、PCR法原理：设计支原体特意的引物，进行PCR扩增。优点：（1）快速，往往只需几小时；（2）可检测的支原体种类较多；（3）目前，该方法是细胞培养液中支原体污染检测的常规方法之一。缺点：（1）整个过程大约需要3个小时；（2）由于细胞培养数天后，培养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物，所以样品的前处理一般是PCR法不可或缺的环节；（3）PCR产物的电泳，需要用到EB等潜在的致癌物质；（4）需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器；（5）存在假阳性和假阴性。《PCR法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）Sigma公司的LookOutMycoplasmaPCRDetectionKit（货号：MP0035），价格：价格：3469元/24次；（2）上海易色医疗科技有限公司的《PCR法支原体检测试剂盒》，货号：PM008；价格：1000元/100次；（3）以色列BiologicalIndustries（BioInd）公司的EZ-PCRMycoplasmaTestKit，货号：20-700-10，价格：约1000元/10次。四、RD-RCA恒温扩增法原理：这个是上海易色医疗科技公司依托其RD-RCA恒温扩增技术开发的支原体检测产品，产品名称：《一步法恒温支原体检测试剂盒》。该产品非常具有特色，详细原理可以访问其网站了解。优点：《一步法恒温支原体检测试剂盒》使用独特的RD-RCA恒温基因扩增技术，彻底解决了上述PCR法的缺点：（1）整个检测过程只需1小时，大大缩短了检测时间；（2）细胞培养液中的PCR抑制剂，不会抑制该产品的恒温基因扩增，所以任何情况下都无需样品的前处理；（3）恒温基因扩增的灵敏度是PCR法的10-1000倍，检测只需使用1μL的细胞培养3/3液，无需样品的离心浓缩或者进行支原体DNA的抽提；（4）恒温基因扩增的产物无需电泳，可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果；（5）无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器，整个检测过程只需一个水浴锅。缺点：该产品只能保证认识最常见的污染细胞的13种支原体，虽然这13种支原体大约占污染细胞的支原体种类的99%左右。但是，不排除《一步法恒温支原体检测试剂盒》无法识别个别在体外细胞培养中出现概率极低的支原体。《RD-RCA恒温扩增法支原体检测试剂盒》主要厂家：据笔者了解，目前只有上海易色医疗科技公司生产《一步法恒温支原体检测试剂盒》，货号：MD001，价格大约15-19元/次五、酶活法原理：通过检测支原体特异性ATP合成相关酶的活性。优点：（1）支原体识别率高，100多种支原体，只有1种不能识别，而不能识别的这种支原体几乎不会出现在体外培养的细胞中；（2）可以区分支原体的死活；（3）不存在假阳性和假阴性；（4）检测时间短，整个检测过程只需25分钟。缺点：需要用到具有发光检测功能的多功能酶标仪或独立的发光检测仪。《酶活法支原体检测试剂盒》主要厂家：（1）上海易色医疗科技有限公司的《发光法支原体检测试剂盒》，货号：LM009；价格：1250元/50次。（2）Lonza公司的MycoAlertPlusMycoplasmaDetectionKit，货号：LT07-710；价格：大约10000元/100次。总结：以上每种支原体检测方法各有优缺点，大家应该根据自己试验的需要和实验室条件进行选择。此外，作为支原体检测领域的共识，单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒和检测方法，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。