waters-2008-MS_12_LC-MS-method-development

©2008WatersCorporationLC/MS实验方法开发©2008WatersCorporation2主要内容LC-MS的实验目的电离方式的选择—ESI或APCI—正离子或负离子色谱柱因素—直径和流速—管路连接（Plumbing）流动相因素—pH—溶剂—其他液质联用应用实例©2008WatersCorporation3基质干扰：Loop进样InMethanolInTomatoJuice©2008WatersCorporation4基质干扰:用色谱柱将基质和分析物分离InMethanolInTomatoJuice©2008WatersCorporation5流速样品类型MW范围电离方式(mL/min)ESI0.001-1.0多电荷离子200,000DaMW1000Da(M+H)+,(M-H)-及其碎片1000DaAPCI0.2-2.0(M+H)+,(M-H)-及其碎片1000DaESIvs.APCI©2008WatersCorporation6电喷雾(ESI)优点—分子量信息—适合于挥发性和非挥发性分析物—适合于离子型/极性分析物—灵敏度高—高分子量测定—适合毛细管高效液相色谱缺点—对LC流速有一定的限制，流速较低—在溶液中必须形成离子—在高盐浓度的条件下，容易有离子抑制—有限的结构信息©2008WatersCorporation7适合于ESI分析的化合物典型正离子分析样品—肽和蛋白—弱极性化合物—环境污染物，例如农药和污染物—毒品、违禁物及其代谢产物典型负离子分析样品—某些蛋白—寡核苷酸—有些糖(saccharides)和多聚糖(polysaccharides)—某些药物的代谢物(例如葡糖苷酸共轭物(glucuronideconjugates)©2008WatersCorporation8大气压化学电离(APCI)优点—分子量确认—使用方便—耐用性好—匹配LC高流速2.0mL/min—灵敏度高缺点—有可能发生热裂解—在低质量端的化学噪声大—不适合分析分子量大于MW1000Da的样品—有限的结构信息©2008WatersCorporation9适合于APCI分析的化合物抗菌素(Antibiotics)碱性药物(Basicdrugs)小分子化合物甾族化合物(类固醇Steroids),雌激素类(estrogens)苯并二氮杂卓类(Benzodiazepines)很多适合EI电离源的样品©2008WatersCorporation10柱径因素4mmi.d.2mmi.d.1mmi.d.0.5mmi.d.4000ng1000ng250ng62ng得到相同的信号强度，绝对进样量和柱径的关系©2008WatersCorporation11柱径因素（续）PeakHeightvs.ColumnDiameterCONDITIONS:250picomolesACTHpeptidesonaBondapakC18column©2008WatersCorporation12流速因素流速(ml/min)(50/50ACN/H20)00.51.01.52.050100RelativeintensityAPCIPneumaticallyassistedESI‘Pure’ESI©2008WatersCorporation13质谱接口的流速(HPLC色谱柱)色谱柱内径流速*进入MS的流速mmL/minESIAPCI4.61000分流或直接直接3.9500分流或直接直接2.1200-350直接直接1.050-100直接N/A0.3(毛细管)10直接N/A©2008WatersCorporation14质谱接口的流速(UPLC色谱柱)色谱柱内径流速*进入MS的流速mmL/minESIAPCI2.1~500直接（调节气流）直接1.0~200直接N/A©2008WatersCorporation15LC大流速分流分流的目的—得到最优化的流速条件—减少离子源污染—节省部分珍贵的样品分流～250uL/min进入质谱—测量进入MS的流量由于浓度的因素可以保证ESI在柱后分流之后不损失信号强度©2008WatersCorporation16LCSolventdeliverysystemSplit(Optional)WasteProbeLC大流速分流（续）AnalyticalColumnMS©2008WatersCorporation17ZeroDeadVolume‘T’PEEKTubingPEEKTubingElectrosprayProbeWaste,PDAorFractionCollectorAnalyticalColumn做一个分流器提高进入MS流速可以：—加大废液管的长度—减少废液管的直径©2008WatersCorporation18流速因素梯度延迟—2695系统体积（柱前体积）为600uL，Acquity系统体积约150uL—2695在200uL/min,需花费大约3min抵达柱头—Acquity在500uL/min，需花费大约0.3min抵达柱头—色谱柱平衡时间—柱体积=r2L—为得到好的柱平衡需要运行:(3x系统体积)+(5x柱体积)—AcquityUPLC的柱平衡时间约2min©2008WatersCorporation20管路连接不锈钢管—通常为LC使用PEEK管—通常为LC/MS使用—易于连接—易于被DMSO,THF,CH2Cl2等溶剂溶涨—易于被HNO3,H2SO4等腐蚀©2008WatersCorporation21减少死体积InjectortoColumnColumntoDetectorDetectorCellTypeBandspreadLChangeSystemVolumeL30x0.00918x0.020Waters48696+7230x0.00918x0.009Waters48651030x0.00918x0.009Waters99635-610x0.00918x0.009Waters99630-2610x0.00918x0.005Waters99624-4410x0.00918x0.005Waters996microbore21-49*SuccessivechangesfromRow2*©2008WatersCorporation22下图:‘差的’色谱结果注意：色谱峰高降低，峰宽加大，较早洗脱的色谱峰拖尾尤甚上图:‘良好的’色谱结果谱带展宽比较©2008WatersCorporation230.090ParkerStyle0.130WatersStyle其它Waters®色谱柱WatersSpherisorb®和许多其它品牌系统配置(1):色谱柱接头的种类©2008WatersCorporation24确保色谱柱适当连接确保螺钉和锥箍固定在合适位置色谱柱接头的安装注：色谱柱接头连接不当—产生死体积(Parker型锥箍与Waters接头连接)密封(连接)良好(建议:使用PEEK接头)死体积©2008WatersCorporation25由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽谱带展宽死体积连接适当连接不妥©2008WatersCorporation26.009.020.040注意：连接管路内径的差异！对于LCMS常用0.007″或0.005″的管路系统配置(2):管路内径©2008WatersCorporation27连接管路的影响:柱外谱带展宽.009.020.040样品谱带在管路内发生了扩散过长的管线亦会造成较大的谱带展宽©2008WatersCorporation28实例1：管线内径对柱效的影响J.Li下图：柱效：4000用0.04″内径的管路测柱效的色谱图上图：柱效：1,1000用0.009″内径的管路测柱效的色谱图注：测试同一根色谱柱—在色谱柱与进样器之间使用不同内径的管线©2008WatersCorporation29实例2:谱带展宽对分离度的影响7.007.508.007.007.508.00•用户自己进行管线连接•灵敏度降低•仪器：QuattroUltima•代谢产物研究•改善了管线连接•更换了进样器与切换阀及质谱检测器之间的10个接头•拆掉了4′内径0.005″的多余管线•灵敏度提高一倍•位于主峰尾部的代谢产物得以分离检测用户原有色谱系统优化的系统J.LiES-TIC©2008WatersCorporation30液质联用中流动相的选择有利于色谱分离-满足LC的需要有利于电离—满足MS的需要流动相纯度—影响质谱检测的重要因素对样品的溶解度对色谱柱填料的损害©2008WatersCorporation312weeks1day1week1hourControl5101520250Minutes保存于聚乙烯瓶中的超纯水ConditionsWatersamples:40mltraceenrichment@2.0ml/minColumn:C18reversedphase(Waters)Gradient:linear100%waterto100%acetonitrileWavelength:254nm©2008WatersCorporation321day1weekControl5101520250Minutes保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水ConditionsWatersamples:40mltraceenrichment@2.0ml/minColumn:C18reversedphase(Waters)Gradient:linear100%waterto100%acetonitrileWavelength:254nm©2008WatersCorporation33pH因素—来自MS的要求分析碱性化合物-正离子模式—加酸降低pH—例如:甲酸或乙酸，甲酸铵-甲酸，乙酸铵-乙酸分析酸性化合物-负离子模式—加碱提高pH—例如:氨水，碳酸氢铵-氨水分析混合物或未知物-正、负离子同时扫描©2008WatersCorporation34pH值的影响©2008WatersCorporation35pH值的影响©2008WatersCorporation36pH因素—来自反相HPLC的要求分析酸性化合物–若有利于保留—加酸性缓冲盐,控制低pH,抑制酸性样品的电离—例如:磷酸盐或乙酸盐分析碱性化合物–若有利于保留—加碱提高pH,例如:氨水,三乙胺,但只有少数色谱柱可以忍受(硅胶基质色谱柱pH为2－8)—加离子对试剂(对大多数色谱柱)LC与MS在流动相上的矛盾解决方案：选用合适的色谱柱，避免使用缓冲盐，或选用对MS影响较小的缓冲盐©2008WatersCorporation37LCMS常用的流动相和添加剂流动相—水—乙腈—甲醇—乙醇—丙醇—异丙醇添加剂—乙酸—甲酸—氢氧化铵—甲酸铵*—乙酸铵*—碳酸氢铵*盐浓度应限制在10mM以下。©2008WatersCorporation38不适宜的添加剂非挥发性的盐(磷酸盐,硼酸盐,柠檬酸盐,等等)—会在离子源部分结晶、沉积(需要更多的清洗和保养)—ZSpray设计可以最大程度的容忍不挥发性的盐表面活性剂/洗涤剂—会抑制电喷雾电离无机酸—腐蚀剂(具腐蚀性)©2008WatersCorporation39不适宜的流动相和添加剂三氟醋酸(TFA)浓度0.01%时会抑制电喷雾的正离子会大大抑制电喷雾的负离子三乙胺(TEA)对弱碱性化合物而言，将会抑制电喷雾的正离子极容易电离得到非常强的m/z102分子离子（MH+）四氢呋喃(THF)100%THF非常易燃如果雾化气中含有较多空气时，不要用于APCI©2008WatersCorporation40TFA对利血平(ESI)响应值的影响010203040506070809010000.010.020.050.10.2%TFA(0是50/50ACN/H2O)Response©2008WatersCorporation41一般而言,样品信