搜索
应用竞争PCR检测丙酸盐对体外培养牛肝细胞丙酮酸羧化酶mRNA水平的影响徐闯，夏成，刘国文，王哲*，李家奎，张乃生，王兴龙，欧阳红生，张永亮（吉林大学农学部畜牧兽医学院，吉林长春130062）摘要：应用PC(丙酮酸羟化酶)基因组与PCcDNA相比包含内含子序列及在其中插入外源DNA序列的方法，改变PCcDNA的长度，成功构建PCcDNA的竞争DNA模板。然后应用竞争PCR方法研究丙酸盐对体外培养新生牛单层肝细胞PCmRNA水平的影响。使单层肝细胞培养液中丙酸钠浓度分别为0mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L、3.5mmol/L、4.5mmol/L、8.5mmol/L和11.5mmol/L，处理24小时，提总RNA、逆转录，在同一体系中用相同引物扩增目的带和竞争模板带。结果表明：随着丙酸钠浓度的升高PCmRNA水平呈上升趋势。指示肝细胞内PCmRNA的表达水平受培养液中丙酸钠浓度的影响。关键词：丙酮酸羧化酶mRNA；竞争PCR；肝细胞；内含子EffectionofPropionateontheExpressionofPyruvateCarboxylasemRNAinvitroculturebovineHepatocyteDeterminatedbyCompetiveReverseTranscriptionPolymeraseChainReactionXUChuang,XIACheng,LIUGuo-wen,WANGZhe*,LIJia-kui,ZHANGNai-sheng,WANGXing-long,OUYANGHong-sheng,ZHANGYong-liang（AgricultureDepartmentofJiLinUniversity,PrologueandVeterinaryInstitute,JiLin,Changchun130062,China）Abstract:CompetiveDNAtemplateofpyruvatecarboxylase(PC)cDNAwasconstructedthroughthemethodsofintronsequenceandinsertionsequence.Then,theeffectofpropionateontheexpressionofPCmRNAinvitroculturebovinehepatocytewasquantitativelydeterminatedbycompetivePCR.Propionatewasaddedintotheculturemediaasvariousconcentrationof0mM,1.5mM,2.5mM,3.5mM,4.5mM,8.5mMand11.5Mm,culturedfor24h,andthentotalRNAwasextracted，reversetranscriptionwasdone，usingthesameprimertoamplifyobjectivegeneandcompetivegene.Results:PCmRNAlevelinhepatocyteareenhancedwithincreaseingofpropionateconcentration.ItisconcludedthatpropionatecouldinfluencePCmRNAlevelinlivercellofdairycow.Keyword:PCmRNAlevelcompetiveRT-PCRhepatocyteintron丙酮酸羟化酶（pyruvatecarboxylase，PC）位于肝细胞内，是糖异生途径的关键酶之一，在催化丙酮酸生成草酰乙酸过程中起着至关重要的作用。PC基因的表达量直接影响肝脏糖异生的能力，对调控机体的能量代谢，特别是维持反刍动物的能量平衡具有重要作用。丙酸盐是反刍动物肝糖异生的主要生糖先质，是反刍动物的主要能量来源。本试验采用定量PCR方法，检测了不同浓度丙酸钠对新生牛原代培养肝细胞PCmRNA水平的影响。为进一步研究与糖异生有关的能量代谢障碍性疾病奠定了基础。1材料与方法1.1材料RPMIMedium1640，购自Gibco公司；D-hanks、小牛血清自制；焦磷收稿日期：2003-12-20基金项目：国家自然科学基金资助项目（30230620）作者简介：徐闯（1979-），男，硕士。*通讯作者1酸二乙酯（DEPC），购自Sigma公司；反转录酶（AMV），OligdT，DNA聚合酶，PMD18-T载体，限制性内切酶EcoRI、HindIII、ApaI，T4DNA连接酶，均购于TaKaRa公司；总RNA提取TRIPURE试剂盒，购于Roche公司；质粒、DNA回收试剂盒，购于杭州维特洁生物技术公司；CollagenaseII，购于Gibco公司；PMD-GH质粒，由本室李家奎老师构建；RNA/DNAcalculator，PharmaciaBiotech公司。1.2引物设计根据GenBank中PC基因mRNA序列，设计1对引物，由上海生物工程有限公司合成。上游引物，5/-CCCCTGGAGCGTGTGTTCGACTAC-3/；下游引物，5/-GGATGCCGATGTAGCCCTGCAGGA-3/。扩增片段大小为385bp。1.3新生牛肝细胞单层培养模型的构建参照有关报道[1，2]。将未哺乳新生牛静动脉放血处死，无菌条件下采取肝后叶组织，去除肝表面结缔组织和肝内大血管，用D-hanks液冲洗2次，剪碎成1mm3左右组织块，再用D-hanks液洗涤2次，离心回收组织（注意：离心速度不要超过1000r/min），加入0.125%胶原酶II，37℃水浴40min（此期间轻微颠倒数次，最好在消化过程中吹打1次），加入等量含10%小牛血清的1640培养液终止消化，洗涤细胞2次（1200r/min，5min），去除胶原酶，分散细胞和组织，将悬液通过100目尼龙网滤器，收集细胞，充分分散细胞后计数。按每孔1×106个细胞接种于6孔板，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天换液，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。培养4d后细胞完全贴壁即可进行试验。肝细胞为原代培养，不能传代，生长周期为7d左右。通过测定细胞培养液中白蛋白等确定其生物学活性。1.4PCcDNA的克隆测序1.4.1总RNA的提取按试剂盒说明操作。1.4.2cDNA合成及PCR扩增按试剂盒说明操作。PC基因的逆转录反应体系：总RNA5µl，Oligo（dT）50pmol，5×RTBuffer4µl，dNTPMixture20mMeach，RnaseInhibitor40U，AMV10U，加无菌H2O至20µl；反应条件：70℃变性5min，0℃退火5min，42℃逆转录90min，90℃AMV失活5min，0℃冷却5min。PC基因的PCR反应体系：Taq2.5U，10×PCRBuffer（Mg+）2.5µl，dNTPMixture10mMeach，cDNA2µl，primer（10µM）各1µl加无菌H2O至25µl；反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸10min。1.4.3PCcDNA的克隆测序PCcDNA克隆，应用PMD18-T载体，按常规方法操作。克隆质粒作PCR鉴定和酶切鉴定，对阳性菌落提取质粒作测序分析。1.5PC基因竞争模板的构建提取牛肝脏基因组，用设计的特异性引物扩出PC基因的DNA序列，利用其中含有的一个内含子序列，再插入一段从PMD-GH质粒上酶切下的212碱基片段来构建竞争模板。1.5.1PMD-PCDNA质粒的构建肝组织基因组的提取，按试剂盒说明操作。PCR扩增条件同上。PMD-PCDNA基因克隆用PMD18-T载体，按常规方法操作。质粒作PCR鉴定和酶切鉴定，对阳性质粒作测序分析。1.5.2PMD-GH质粒和PMD-PCDNA质粒的酶切按试剂盒说明操作。用ApaI分别对PMD-GH质粒和PMD-PCDNA质粒进行单酶切，分别回收212bp的PMD-GH质粒（本实验室保存的猪生长激素cDNA质粒载体）酶切片段和PMD-PCDNA质粒酶切片段。1.5.3酶切片段的连接PMD-GH质粒酶切的212bp片段与PMD-PCDNA质粒酶切片段的连接，按试剂盒说明进行操作。用T4DNA连接酶连接GH片段与PMD-PCDNA片段。质粒作PCR鉴定和酶切鉴定，对阳性菌落提取质粒进行序列分析。对挑选出的PMD-PCDNA-GH质粒，用设计的特异性2引物扩增，回收目的片段，即可作为竞争DNA模板。1.6丙酸盐对体外原代培养新生牛肝细胞PCmRNA水平的影响取接种于6孔板培养4d生长良好的肝细胞，加入丙酸盐终浓度分别为0、1.5、2.5、3.5、4.5、8.5、11.5，每个浓度组作3个重复，培养24h后，倒掉培养液，加入Tripure试剂，每个重复分别提取总RNA，按试剂盒说明操作。1.6.1RNA定量采用PharmaciaBiotech公司的RNA/DNAcalculator测定RNA的浓度。1.6.2竞争模板浓度、循环数及RNA完整性的确定用ddH2O对竞争模板倍比稀释后，用特异性引物在同一体系里同时扩增PCmRNA和竞争模板，以电泳的结果来确定竞争模板的最佳浓度。循环数的确定，是根据RNA浓度最高一组的逆转录产物cDNA作模板进行PCR扩增，循环数由20~40个进行摸索，扩增控制在平台期之前[5]，最终确定最佳循环数为35个。完整性测定，按参考文献进行[6]。1.6.3不同浓度丙酸盐对肝细胞PCmRNA水平的影响根据测定的RNA浓度调整总RNA的体积，使各组体系的RNA量相同，且每组均含相同量竞争模板。RT反应条件同上，PCR反应为35个循环，条件同上。RT-PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图片用凝胶分析软件计算密度比例，进行统计学分析。2结果2.1PC基因的RT-PCR扩增、PC基因的克隆及其酶切和测序RT-PCR扩增出1条385bp片段（图1），大小与预期设计的相符。测序结果表明，基因重合率为99.5%，只有2个碱基发生突变即第90位碱基T突变为C，第93位碱基C突变为T（图2）。证明所获得的片段为PCcDNA片段。酶切的目的片段包括载体的多克隆位点序列。酶切鉴定用质粒多克隆位点的EcoRI和HindIII位点进行。cccctggagcgtgtgttcgactacagcgagtactgggagggggcccgggggctgtacgcggcctttgactgcacggccaccatgaagtccggtaactcggacgtgtatgagaacgagatcccagggggccagtacaccaacctgcacttccaggcgcacagcatggggctcggctccaagttcaaggaggtcaagaaggcctacgtggaggccaaccagatgctgggcgacctcatcaaggtgacgccctcctccaagatcgtgggggacctggcccagttcatggtgcagaacgggctgacccgagctgaggccgaagcgcaggcagaggagctgtccttcccccgctcggtggtggagttcctgcagggctacatcggcatcc图2PCmRNA测序结果阴影部分为引物序列，方框内为突变基因2.2PC基因组DNAPCR扩增、PCDNA质粒酶切和测序从基因组DNA中，扩增出1条约466bp的片段（图1），PCDNA质粒酶切结果（加上目的片段两边的多克隆位点）与该片段大小相符。测序结果表明，只有2个基因发生突变第108位碱基T突变为C，第338位碱基A突变为C，PC基因序列包含有一内含子，大小为81bp，位于上下游引物的中间位置（图3）。CCCCTGGAGCGTGTGTTCGACTACAGCGAGTACTGGGAGGGGGCCCGGGGGCTGTACGCGGCCTTTGACTGCACGGCCACCATGAAGTCTGGC