PCR实验室分区设置和要求-PPT幻灯片

分子生物学实验室设置及要求甘肃省疾病预防控制中心二○一一年四月张林才1在由中华人民共和国卫生部办公厅于2002年1月14日下发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。设计根据2临床PCR诊断实验室设计方案工作流向专用走廊产物分析区扩增区标本制备区试剂准备区缓冲区缓冲区缓冲区空气流向空气流向空气流向空气流向3错误的设计4临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。5在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。6试剂准备区设置要求·超净工作台或试剂配置箱·试剂冰箱·可调移液器一套（四支），·配有带滤芯（防止气溶胶）及无RNase酶的吸嘴·无粉的乳胶手套·涡旋器·专用工作服·无菌离心管·7下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。8含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于热启动技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。9严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯(254nm波长)，在工作完成后调至实验台上60~90cm内照射。由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。10标本制备区设置要求·生物安全柜·样本冰箱·可调移液器一套（四支），·带滤芯（防止气溶胶）及无RNase酶的吸嘴·台式微型离心机（最大RCF16000g，最小RCF12500g）；·试管架（Sarstedt93.1428）·无粉的乳胶手套·涡旋器·专用工作服·无菌离心管·加热块11下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。12用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成，因为cDNA链较RNA稳定，保存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后再开盖以调节缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩增。13扩增区设置要求·CobasAmplicor·NucliSensEasyQ·LightCycler荧光定量PCR仪·LightCyclerCapillaryReleaser·专用工作服·PCR扩增仪14下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。不能从本区再进入任何上游区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。15为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。用过的加样器必须注意清洁消毒。完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。16产物分析区设置要求·孵箱·洗板机·酶标仪·数据处理系统·专用工作服17下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记)、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法等。目前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探针杂交方法。18本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1mol/LHC1中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1mol/LHCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。19分子生物学实验室20PCR试剂准备区工作细则1.操作者应穿普通白大衣，戴套袖、手套、口罩。2.超净工作台内备有PCR管架1个，200ul、20ul、2ul加样器各一把，此外还放置高压后PCR管饭盒，枪头盒、记号笔及废液缸，这些物品均不得拿出超净工作台外。3.超净工作台内只进行打开和配制试剂的操作，不得在内加样。4.配制试剂及反应体系前应将试剂混均，粉末状试剂应先离心后再溶解。各种酶类应放置在自制冰盒上。配制完毕后应及时将剩余试剂放回贮存区域。5.反应管应放在自备的架上或夹在手指缝中带到样品制备区。6.试剂按位存放，最高层放高压去离子水，第一抽屉放酶、底物、引物、缓冲液。每人分装小份试剂使用。第二、三抽屉备用试剂，每人分装各自所用标本放于各自标本盒中，防止交叉污染。7.一周内经常使用的底物、引物、缓冲液可放4℃保存。8.每天实验结束后，实验区紫外线照射30分钟。21标本制备区22核酸样品制备区工作细则1.所有操作均在生物安全柜中进行，操作者戴口罩，穿外被，戴双层手套操作。所有废弃物应按照HIV污染物品处理。自试剂准备区来者不必更换手套。2.1000ul、200ul、20ul加样器各1把，涡旋振荡器要放在生物安全柜中。3.离心时离心管按小把朝外的一致方向放置，螺口管做好方向标记。4.按照试剂盒操作说明提取核酸，提取结束后，立即分装保存，并留少量检测用。5.RT反应和套式PCR的反应在此区加样，带自制空气隔塞加样用的枪头。加样完毕后，在反应管上做好标记。6.实验结束后，立即将HIV阳性污染物垃圾高压处理，高压条件：121度，50分钟。实验区紫外线照射30分钟。7.用全自动核酸提取仪提取核酸后应执行去污染程序，紫外线照射8小时。23扩增区24PCR扩增区工作细则1.操作者应穿本区工作服，戴双层手套，自核酸样品制备区来者不必更换手套。2.按PCR仪操作规程创建自己的反应程序，记录自己的反应程序号，以后直接运行该程序。3.如果创建反应程序过程中，机器出现某程序号与其他程序号相关联的情况，要另选新的程序号，以免误将别人的程序篡改。4.每次运行程序前一定要核对该程序的内容。5.运行结束后，及时取出反应管，关闭机器并填写记录，勿使机器在无反应管的情况下空运行。6.每天工作完毕后紫外线照射工作区，每周一，三除尘。7.当机器发生故障时，立即上报负责人。25产物分析区26产物分析区工作细则1.操作者应穿本区工作服，戴双层手套、口罩。工作时关闭隔断门。2.电泳区备有小型、大型水平电泳槽，垂直电泳槽，以及8×12孔HLA基因分型专业电泳槽，可作各种琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，定性、定量检测核酸及蛋白质。3.200ul、20ul加样器各1把，此外还备有8道排枪1把，均为电泳区专用，不得拿出电泳区。4.电泳所用缓冲液与配胶所用缓冲液同期配制。5.上样缓冲液为6×，使用时，取1份上样缓冲液，加5份样品，可在封口膜上混均，也可在样品管中进行。注意：当对提取核酸进行检测时，切不可将样品直接拿到电泳区检测，应在试剂准备区外间把上样缓冲液点道封口膜上，取适量样品混均并记下样品顺序，将点有样品的封口膜拿到电泳区检测。6.电泳缓冲液用量要合适，以刚好浸没过胶面为宜。过多溢出可能有触电危险，过少影响电泳质量。7.电泳结束关闭电泳仪后才可取出凝胶成像。8.凝胶放入暗箱，关好暗箱门。电脑和凝胶成像仪上方的摄像设备是清洁的，应摘下手套调节。9.按照凝胶成像仪操作规程调节获取满意的图象，照相后立即关闭紫外灯并将凝胶取出，切勿使其在暗箱中干燥板结。10.珍惜打印用纸，只在必要时打印图象。11.每天工作结束后打开紫外灯照射30分钟。12.每周一，三除尘并倒垃圾。13.当机器发生故障时，立即上报负责人。27怎样编写SOP？28知识回顾KnowledgeReview