β-胡萝卜素和番茄红素的提取分离与测定

β-胡萝卜素和番茄红素的提取分离与测定1．实验目的：掌握色素提取方法、柱层析分离方法及薄层色谱初步定性方法。了解β－胡萝卜素与番茄红素性质的差别。2．实验原理：番茄中含有番茄红素和少量的β－胡萝卜素，二者均属于类胡萝卜素。类胡萝卜素为多烯类色素，不溶于水而溶于脂溶性有机溶剂。本实验先用乙醇将番茄中的水脱去，再用二氯甲烷萃取类胡萝卜素。因为二氯甲烷与水不混溶，故只有除去水分后才能有效地从组织中萃取出类胡萝卜素。根据番茄红素与β－胡萝卜素极性的差别，用柱层析可以将它们分离。分离效果可以用薄层层析进行检验。3．实验仪器及材料：新鲜番茄（或番茄酱）。95％乙醇，二氯甲烷，石油醚（60℃～90℃），氯仿，中性或酸性氧化铝（柱层析用），环己烷，硅胶G，饱和氯化钠溶液，无水硫酸钠。4．实验过程：1）原料处理与色素提取称取新鲜番茄浆20g于100mL圆底烧瓶中，加95％乙醇40mL，摇匀，装上回流冷凝管，在水浴上加热回流5min，趁热稠滤，只将溶液倾出，残渣留在瓶内，加入30mL二氯甲烷，水浴上加热回流5min，冷却，将上层溶液倾出抽滤，固体仍保留在烧瓶内，再加10mL二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和2次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5mL饱和氯化钠溶液（有利分层），振摇，静止分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有疏松棉花且在棉花上铺一层1cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗，以除去微量水分。将此溶液贮存于干燥的有塞子的锥形瓶中。层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。2）层析柱的制备取一支长15cm左右内径为1-1.2cm的干燥的层析柱，将其垂直固定于铁架上，底部铺上少量棉花，打开活塞。称取8g氧化铝小心倾入层析柱中，在氧化铝上铺一层棉花。然后向柱内加入15ml石油醚，让溶剂浸润并流过层析柱，注意柱顶部溶剂不能干涸。待溶剂液面刚好与氧化铝表面相切时，关闭活塞，备用。3）柱层析分离向蒸干的粗样品中加入2ml苯使其溶解。用一长颈滴管取样，小心滴入层析柱内，注意产品不能接触柱壁。打开活塞，让溶液自然流下，待液面刚好与柱顶氧化铝表面相切时，加入2ml石油醚，用50ml干燥的锥形瓶接收滴出的溶液。待溶剂液面与氧化铝表面相切时，再加入8ml或更多的石油醚，至滴出的溶液无色，关闭活塞，收集红色的番茄红素溶液(a)；打开活塞，再往层析柱中先后加入2ml及8ml的氯仿，洗至滴出的溶液无色，用另一50ml干燥的锥形瓶接收，关闭活塞，收集黄色的β-胡萝卜素溶液（b）。然后用相应温度的水浴蒸干(a)、(b)，差重法分别称出相应浓缩物的重量Wa、Wb(精确到0.0002)。4）苏丹红(Ⅱ)工作曲线用分析天平准确称取约5.0mg苏丹红(Ⅱ)于小烧杯中，加入少量溶剂(建议用氯仿)在通风橱内水浴加热搅拌溶解，待溶液冷却至室温后全部转移到100ml的容量瓶中，用溶剂(建议用氯仿)稀释定容至刻度线，可得到50μg/ml的标准液。然后用10ml的移液管分别移取该溶液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于五个25ml的容量瓶中，然后加入溶剂将其稀释定容至刻度，它们浓度分别为4μg/ml、8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml、20μg/ml。用该溶剂作参比溶液，在波长为510nm下分别测其吸光度，以吸光度对浓度作图，可得到吸光度对浓度的标准工作曲线图及关系式。