微生物学通报

基金项目：河南省科技攻关项目基金通讯作者：王林嵩E-mail：[e-mail]离子束照射诱变技术构建生物乙醇高产酵母菌株杨浩赵更峰王丽王林嵩(河南师范大学生命科学学院河南新乡453007)摘要:利用原生质体融合、离子束照射诱变等技术构建生物乙醇高产酵母菌株。在35%聚乙二醇(PEG)的作用下将酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母融合，通过不同剂量的氮离子束照射融合子，筛选出能够稳定遗传的子代菌株。诱变后的菌株其酒精产率提高了40%，同时木糖利用率也有所提高。采用不同剂量的氮离子束对融合后的菌株照射能较大幅度的提高菌株的变异几率，从而能减少筛选理想菌株的时间和工作量。关键词:酿酒酵母，管囊酵母，原生质体融合，离子束Ahighproductionofbio-ethanolmicrozymebyionradiatingmutagenesisYANGHaoZHAOGeng-FengWANGLiWANGLin-Song(CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,xinxiang,Henan453007,China)Abstract:Ahighproductionofbio-ethanolmicrozymebyionradiatingmutagenesisandprotoplastfusionIneffectforthe35%PEGtomakepachysolentannophandsaccharomycescerevisiaeprotoplastfusion.ThroughdifferentradiatedosisofN+,filteroutthegenerationofthemicrozymethatcouldinheritthecharacteristic.Theproductivityimprove40%,andthexyloseutilizationratealsoimproved.WithdifferentdosisofN+radiatetheprotoplast，theprotoplastcouldhaveahighprobabilitytoaberrance,andissueinreducetheworksandtimeforfilterthedesirablemicrozyme.Keywords:Saccharomycescerevisiae,Pachysolentannophilus,Intergenericprotoplastfusion,Ionbeam.木糖是木制纤维素中大量存在的一种无碳糖，是自然界最丰富的糖类之一，对它的生物转化具有重要的经济意义1,2。酿酒酵母传统地被酿酒工业应用于从六碳糖生产酒精，并作为宿主菌生产多种外源蛋白3,4。酿酒酵母具有木酮糖磷酸化酶，能利用木酮糖，但缺乏代谢木糖的能力5。本研究利用原生质体融合技术将酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母相融合6～9，扩大其基因交流和重组的范围，获得既能有效利用木糖、又能发酵产酒精的酵母。并在此基础上用氮离子束诱变提高其酒精产率，为植物纤维水解产物的利用打下基础。1材料和方法1.1菌株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)均为实验室保藏菌种。1.2培养基完全培养基:YEPD培养基10;固体完全培养基:在YEPD中添加20g/L琼脂;KCl高渗再生培养基:在YEPD中加入0.8mol/L的KCl。(以上培养基均在121℃灭菌20min处理);TTC上层培养基:TTC(2,3,4-三苯基氯化四氮唑)0.5g/L(过滤灭菌),葡萄糖5g/L，琼脂15g/L(高温灭菌);木糖发酵培养基121.3试剂磷酸缓冲液(PB)13:PH=5.8;高渗磷酸缓冲液(PBS):PB中加入0.8mol/LKCl;酶液：蜗牛酶、纤维素酶用高渗磷酸缓冲液(PBS)配制，经0.22μm微孔滤膜过滤灭菌11;促融合剂:35%PEG(MW4000)，内含0.01mol/LCaCl2(过滤灭菌)14以上试剂除酶以外均经过121℃高温灭菌20min。1.4实验方法1.4.1菌体筛选将酿酒酵母接种至固体完全培养基中27℃培养，而后利用TTC上层培养基挑选颜色较深的菌落，经比较选出酒精产率较高的菌株。1.4.2制备原生质体将活化的菌种接种至液体完全培养基中振荡培养至对数生长期，用2%的蜗牛酶和2%纤维素酶混合酶30℃轻微振荡处理，每15min定时取样镜检，待视野中90%左右细胞变成原生质体后停止酶解，离心去酶液，加入高渗缓冲液备用。1.4.3原生质体融合将酿酒酵母的原生质体用紫外线30cm处照射60s灭活，嗜鞣管囊酵母原生质体在水浴65℃70min灭活处理，然后置于35%PEG中于40℃处理40min。将反应后的菌液离心并涂布在固体再生培养基上培养，待长出菌落后用TTC上层培养基挑出颜色比较深的融合子，筛选产酒精能力较强的菌株。1.4.4离子束诱变在离子束照射前，将筛选好的菌株用保护剂处理。照射时间与剂量如下:表1照射剂量和处理时间Table1DosisofradiateandprocessingtimeDosis/×1014eV2351020305080Processingtime/s12.118.232641281923205122结果2.1亲本酿酒酵母产酒精能力的测定从十株酿酒酵母中通过重铬酸钾法15测定筛选三株产酒精能力比较强的菌株作为融合亲本菌株。其酒精产率分别达到6.17mg/ml、6.62mg/ml、5.97mg/ml。2.2亲本管囊酵母的木糖利用率的测定用15g/L的木糖发酵培养基振荡培养嗜鞣管囊酵母，用DNS法(3,5-二硝基水杨酸法)测定发酵液中还原糖含量，残糖浓度为1.45g/L,其木糖利用率为90.3%。2.3融合子产酒精能力和木糖利用率的测定融合子经过TTC反应，筛选出若干株酒精产率比较高的融合子(通过颜色判定)，测定其木糖的利用情况。筛选出一木糖利用率最高的菌株，经过木糖培养基培养，残糖浓度为1.27g/L，其木糖利用率为91.53%，酒精度为6.45mg/ml。2.4离子束诱变后菌株的产酒精能力和木糖利用率的测定该菌株进行不同剂量的离子束照射后，经筛选发现，用计量为3×1015eV照射过的菌株酒精产率增幅最大，酒精产率由原来的6.45mg/ml上升到9.01mg/ml，残留木糖浓度为0.23g/L，利用率达到98.4%。3讨论当前，离子束技术已广泛应用于微生物诱变16。在本实验中，利用氮离子对融合子进行诱变照射，成功诱变出比母本酒精产率不同程度提高的酵母菌株。而且，得到的新菌株对木糖的利用率比母本有所提高。单一的通过原生质体融合能使两种酵母菌的基因杂交，扩大基因的交流范围，在这过程中产生突变的几率很小，融合后新菌株的各项指标都维持在亲本菌株的水平；而单一的通过离子束照射诱变能大幅增加基因的突变几率，但是要诱变出有理想性状的菌株则需大量的亲本菌株和大量的筛选工作17。相对于以上两种方法，采用先通过细胞融合筛选出含有亲本性状的菌株，再通过离子束诱变含有两亲本基因的菌株能够大大的提高诱变出理想型菌株的几率，同时减少菌株筛选的时间和工作量。通过以往相关实验表明，通过外界的离子注入与生物体相互作用，只要实验系统中含有氮元素参与，不管氮元素是来自外界还是生物体本身含有的，都有一定的几率形成氨基或氨基酸18，这种新的氨基酸分子的合成可能对DNA的产生和基因调控序列产生影响；即使离子注入没有使菌株结构基因发生突变，调控序列的修饰同样可以导致菌株遗传性突变。实验选择氮离子注入可以在相对温和的情况下获得目的菌株。采用氮离子照射时，在剂量为2×1014eV～8×1014eV范围内产生HRS/IRR效应。然而当剂量增加到3×1015eV～8×1015eV时，菌株的存活率显著提高，表明该菌株随着剂量的提高抗性也有所增强，这一现象与其他微生物的研究成果有所差别，原因有待进一步研究19。若HRS/IRR效应损伤严重而得不到修复则导致细胞死亡；若损伤得到修复且修复正确，则获得突变菌株的几率下降；所以在细胞存活率低时易于得到突变菌株。参考文献[1]OlssonL,Hahn-agerdalB.Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction[J].EnzymeMicrobialTechnol.1996,18:312-331[2]AlexanderMA,ChapmanTW,JefferiesTW.ContinuousethanolprodutionfromD-xylosebyCandidashehatae[J].biotechnol.bioeng.1987,30:685-691.[3]BarnettJA.In:TipsonRS,HortonD(eds),AdvancesinCarbohydrateChemistryandBiochemistry.NewYork:AcdemicPress,1976,pp125～235.[4]JillEOgden.In:PeberdyJF(eds).AppliedMolecularGeneticsofFungi,CambridgeUniversityPress,1991,pp.66～84.[5]Hahn-hagerdalB,NhallomJ,JeppsonHetal.In:SaddlerJN(ed.),CABInternational,Wallingford,UnitedKingdom,1993,pp.231～290.[6]Morgan,A.J.:Inporotoplasts1983,editedbyPotrykusIetal,BirkhauserVerlag.BaselBostonStuttgart.1983,155-166.[7]Taya,M.etalAgric1984;BiolChem,48(19):2239-2243.[8]张博润，何秀萍.酵母菌细胞自溶突变株的研究.微生物学报，2003:43(2).[9]孙建秋，周东坡.微生物原生质体技术[J].生物学通报，2002,37(7).[10]张博润，蔡金科.酵母菌属间原生质体融合.微生物学报.1995，30(3).[11]白罚利，田沈，闫飞，杨秀山.酿酒酵母与嗜鞣管囊酵母原生质体制备研究.2007(25).[12]刘天霞，宋彦彦，张鹏.嗜单宁管囊酵母木糖酒精发酵的研究.纤维素科学与技术.2005.3(13).[13]张龙翔，张庭芳。生化实验方法和技术.北京：人教社出版，1981.[14]王建华，赵学慧.螯合剂对原生质体融合的影响[J].生物工程学报.1998.14.(1).[15]林仁权，胡文兰，陈国亮.重铬酸钾氧化分光光度法测定酒中乙醇含量.2006(18).[16]王丽，郑之明，樊永红，苏彩欣，许德军，柳丹，古邵彬，余曾亮.离子束诱变粟酒裂殖酵母产辅酶Q10的研究.激光生物学报.2007.2(5).[17]毛华，曲音波，高培基，等.酵母属间原生质体融合改进菌株木糖发酵性能.生物工程学报12,157～162，1996.[18]余增亮.离子束生物技术引论[M].安徽科技出版社.1998:9-14,81-105,176-190.[19]刘国生，赵婷，王秀强，等.N+注入诱变筛选阿拉伯糖利用缺陷型肌苷高产菌株.中国医药学杂志，2008,39(7).