石蜡切片和HE染色

石蜡切片和HE染色1、取材颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，剪去肝组织（或其他组织）。切取得组织不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm*5mm*2mm或10*mm*10mm*2mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2-3mm厚。注意事项：⑴取材动作要迅速，不宜作太久的拖延一面组织细胞的成分、结构等发生变化。⑵切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。2、固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛中固定，固定30-50min。注意事项：⑴一半固定液，都以新配好为好，配好后应储存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用⑵有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，失去时就没有作用了⑶固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液⑷材料固定完成后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外加上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，一面相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。3、脱水50%→70%→80%→95%→100%→100%酒精。每个0.5h。注意事项：⑴脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分⑵在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂⑶在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体⑷在高浓度或酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。⑸如需过夜，应停留在70%酒精中⑹脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色浑浊现象。4、透明1/2二甲苯+1/2无水乙醇（20min）→纯二甲苯Ⅰ（15min）→纯二甲苯Ⅱ（25min）。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。注意事项：⑴使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。⑵更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料快干涸，另一方面能避免吸收湿气。⑶在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱干净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。5、浸蜡将处理的材料置于1/2石蜡+1/2二甲苯中，56℃s水浴锅40min。再放入石蜡Ⅰ90min、Ⅱ90-120min。透蜡的目的是除去组织中的透明剂，使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱中进行，并保持箱内温度在55-60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。注意事项：⑴尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；⑵透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；⑶操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。6、包埋先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用包埋盒至于60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，吧标签正面向外置于底部，补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。7、切片①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。③摇动推动螺旋，使石蜡与刀口贴近，但不可超过刀口。④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约15度左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米⑥一切调整好后可以开始切片。⑦切成来的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。⑧用单刀面切去蜡块一小段，放在载玻片上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥善保管。8、粘片将粘贴剂置薄玻片，再取切片浮值粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度为30-40℃过夜。9、脱蜡和染色纯二甲苯（10—20min）→纯二甲苯（5—10min）→1/2二甲苯+1/2纯酒精→100%纯酒精→95%酒精→85酒精→70%酒精→50%酒精→自来水冲洗10s→切片放入苏木精中染色约10-30min→用自来水流水冲洗约15min使片变蓝。10、分化和漂洗将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，约至2s至数秒。见切片变红，颜色较浅即可。切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。11、脱水Ⅰ和复染切片如50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。用0.5%一红乙醇液对比染色1-3min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。12、脱水Ⅱ和透明将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后滤纸吸干多余的乙醇，将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。13、封藏中性树胶封存，因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度；批。