琼脂糖凝胶浓度

电泳基本理论内容摘要1概述2电泳的基本原理3电泳系统4支持介质5染料6影响因素1电泳概述1.1电泳的定义带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目等因素有关。1.2电泳技术的发展过程电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家TiseliusA首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年ShapiroAL等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作，建立了各种实验方法，电泳后对分离物质可以用染色、扫描、紫外吸收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析，得到所需数据。1.3电泳的常用术语(1)电泳迁移(electrophoreticmigration)：在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动，单位是cm。(2)迁移时间(migrationtime)：用tm表示在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动所用的时间，单位是min。(3)电泳速度(electrophoreticvelocity)：用Vep表示在单位时间内，带电粒子在电场的作用下做定向运动的距离，单位是cm/sec。(4)电场强度(electricfieldstrength)：用E表示在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电效应，单位是V/cm。E=V/Lt式中V为电压，Lt为两端电极的距离。AB(5)电渗流(electroosmoticflow)：用EOF表示在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷之间相互作用，形成一个正离子层，导致流体朝负极方向移动，称为电渗流，这种现象也称之为电渗(electroosmosis)现象,如图。电渗流迁移速度(Vep)的表达式为：εξ电渗流迁移速度Vep=—————E4πη式中为电解常数，为支持物与表面平切面的Zeta电势，为缓冲液粘度，E为电场强度。通常情况下，电渗流总是由正极向负极移动，只有在特殊情况下如分离碱性蛋白质的阴极电泳时溶液pH较低，固体支持物表面带正电荷，形成向正极移动的电渗流。电渗流的大小受到Zeta电势，偶电层厚度和缓冲液粘度等因素的影响，直观地看电渗流随着电解质浓度的增加而增加，随着pH值的增加而加大。(6)相对迁移率(relativemobility)：用mR表示蛋白质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁移率，即蛋白质的迁移距离(cm)mR=—————————————示踪染料的迁移距离(cm)2电泳的基本原理2.1带电颗粒溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附其它带电质点而带电，在电场中就会发生迁移，移动方向取决于它们的带电符号。NaCl→Na++Cl–生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于溶液终的H+浓度2.2电泳迁移率(mobility)如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中，使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，即：F=QE(1)带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力F’，对于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从Stock定律：F’=6πrηv(2)这里v是在介质粘度为η的溶液中，半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。当带电颗粒达到稳态运动时，F=F’，由(1)、(2)式推导出：vQ———=————（3）E6πrη不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）m来表示，定义为在电位梯度E(V/cm)的影响下，颗粒在时间t(s)中迁移距离d(cm)，即在单位电场强度(1V/cm)时的泳动速度：vdm=——=———(4)Et·E将(3)代入(4)，得到Qm=————(5)6πr由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(4)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。2.3带电颗粒的移动速度v与电位梯度E、电流密度J和导电性K的关系如果在同样实验条件下对某蛋白溶液做两个电泳试验，一个试验用两倍的时间一倍的电压，另一个试验用一倍的时间两倍的电压，从理论上讲，这两个试验中蛋白质的迁移距离应该是相等的。但是实际上只能是大致相等，原因是在电泳过程中还有其他因素的干扰，如在增加电压的同时也增加了热效应。移动的速度决定于其分子的形状、相对分子质量的大小、分子带电性质及数目，还与分离介质的阻力、溶液粘度及电场强度等因素有关。我们把带电颗粒的移动速度用以下公式表示v=m·E=m·J/K(6)由此可以看出，带电颗粒的移动速度v等于电位梯度E和迁移率m的乘积，与电流密度J和迁移率m的乘积成正比，与溶液的导电性K成反比。也就是说，电场强度越高电泳速度越快；溶液的导电性越强，电泳速度越慢。因此电泳速度随着电位梯度或溶液的导电性的变化而改变。3电泳的分类3.1按分离原理分类(1)区带电泳(zoneelectrophoresis，ZEP)：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带(图3-2a)，这是当前应用最广泛的电泳技术。(2)移界电泳(movingboundaryelectrophoresis，MBEP)：是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图3-2b)。(3)稳态电泳(steadystateelectrophoresis)：带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳(isotachophoresis，ITP)、等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)(图2c、2d)。abcd图3-2各种电泳分离原理示意图a区带电泳b移界电泳c等速电泳d等电聚焦4电泳系统4.1电泳仪及附属设备从第一台商品自由移界电泳系统的问世以后，近50年来电泳仪器的发展迅猛，尤其是随着凝胶电泳技术的成熟及广泛应用，各种类型的凝胶电泳装置层出不穷，使电泳技术得以迅速发展。凝胶电泳仪作为实验室的常规小型仪器，种类很多。随着科学技术的不断发展，电泳仪器的分析对象也越来越专门化，分辨率越来越高，操作越来越简单，性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。4.2电泳仪：根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。4.2电泳槽：根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。(1)自由界面电泳槽Tiselius设计的自由界面电泳槽（图3-3）是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。电极电极U形管3Tiselius自由界面电泳装置示意图(2)管状电泳槽50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(discelectrophoresis)。圆盘电泳槽(3)板状电泳槽板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slabelectrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。垂板电泳槽转移电泳槽平板电泳槽双向电泳槽制备电泳槽4.3附属设备随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。5电泳的操作模式目前最常用的电泳操作模式是区带电泳中的聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，前者主要用于蛋白质的分离鉴定，后者主要于核酸的分析鉴定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理分类。5.1按电泳方式分类(1)端电极电泳：有垂直式和水平式两种方式，多用于蛋白质电泳。(2)搭桥电泳：为水平式，水平板状电泳槽形式多样，凝胶和缓冲液通过间接接触的方式，如用滤纸桥搭接，用缓冲液制作的凝胶条或滤纸条搭接（图3-4），后两者即半干技术，多用于免疫电泳、等电聚焦。ABC图4水平板状电泳中凝胶与缓冲液的接触方式A滤纸桥B凝胶条C滤纸条(3)潜水电泳：为水平式，电泳时凝胶浸于缓冲液中，多用于核酸电泳。5.2按分离原理分类(1)净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(3)聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳；(4)聚丙烯酰胺凝胶双向电泳；(5)聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦；(6)聚丙烯酰胺凝胶转移印迹电泳；(7)琼脂糖凝胶水平电泳；(8)琼脂糖凝胶脉冲电泳；(9)琼脂糖凝胶免疫电泳。6凝胶电泳的支持介质6.1支持介质的性质采用支持介质进行电泳的目的是防止在电泳过程中分子的对流和扩散，使被分离物质得到更有效的分离。支持介质应当具备以下特性：(1)物理化学性质稳定：在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。(2)化学惰性：在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。(3)分布均匀：内电渗小，结果重复性好6.2支持介质的分类电泳的固体支持介质可以分为两类:(1)薄膜类：薄膜类包括纸类，醋酸纤维素薄膜，聚酰胺薄膜等.这类支持介质化学惰性好，在电泳过程中产生的对流和扩散较小，分离的基本原理主要是基于生物大分子的电荷密度。(2)凝胶类：凝胶类包括淀粉凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。这类介质相对薄膜类又了进一步，它具有高粘度和高摩擦阻力，它在电泳过程中不仅能防止对流，减小扩散，还具有凝胶的多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，因而能产生分子筛效应(molecularsievingeffect)，其分离作用既与电荷密度有关，又与分子大小有关，因而凝胶的分离原理是基于