SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法

SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚自氧化的方法测定酶活力，利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。一、试剂：1、pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液：A液:称取17.9gNa2HPO4•12H2O于容量瓶中定容至1L；B液:称取7.8gNaH2PO4•2H2O于容量瓶中定容至1L；取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液。2、C液:pH8.20，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(内含1mmol/LEDTA•2Na)：称取1.2114gTris和37.2mgEDTA•2Na溶于62.4mL0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。3、0.lmol/L盐酸溶液:量取2.lmL12mol/L盐酸，蒸馏水定容至250mL。4、.10mmol/L盐酸溶液:量取10mLO.lmol/L盐酸，蒸馏水定容至l00mL。5、D液:4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定容至100mL。二、仪器：1.冷冻离心机2.水浴锅；3．电子天平；4．紫外-可见分光光度计；5．精密酸度计，精确到0.01pH；6．10mL比色管；7．10mL离心管；8．玻璃乳钵。三、实验步骤1．SOD粗酶液的提取称取叶片1g，置于研钵中研磨，加入3mL0.05mol/L磷酸缓冲液，加入少量石英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL至离心管中，于4℃10000r/min离心20min，上清液即为SOD粗提液。2.1邻苯三酚自氧化速率测定在25℃左右，于10mL比色管中依次加入C液体2.35mL，磷酸缓冲液2.00mL,D液0.15mL。加入D液后立即混合均匀并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率ΔA325(min-1)。2.2样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按照2.1步骤分别加入一定量样液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2ΔA325(min-1)，即ΔA'325(min-1)。SOD活性测定加样表试液空白酶提取液1酶提取液2C液/mL2.352.352.35磷酸缓冲液/mL21.51.5样液/mL00.50.5D液/mL0.150.150.15于10mL比色管中立即混合均匀然后倾入比色皿式中:U/mL一SOD酶活力单位;△A325一邻苯三酚自氧化速率;△A`325一样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率;V一所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL);D一酶液或样液的稀释倍数;V1一样液总体积，单位为毫升（mL）；m一样液质量，单位为克（g）4.5一反应液总体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留三位有效数字。