甲霜灵胶体金竞争法试纸

甲霜灵胶体金竞争法试纸条的研制北京万华生物工程有限公司2005.12.8一、前言•农药甲霜灵简介•最高残留限量标准•检测方法的建立•分课题进展情况简单汇报1.农药甲霜灵简介•农药甲霜灵（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米尔、瑞毒霉、甲霜安，化学名称D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2‘-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，属酰苯胺类杀菌剂。•据中国农药毒性分级标准，属低毒杀菌剂。•对卵菌引起的病害具有独特的保护和治疗作用。2.最大残留限量标准•联合国FAO/WHO食品法委员会（CCPR）《关于食品和饲料中农药最高残留限量的规定》中规定每日允许摄入量（ADI）为0.03mg/kg体重，禾谷类植物最高允许残留量为0.05×10-6。•中华人民共和国卫生部和中国国家标准化管理委员会于2005年1月25日发布，自2005年10月1日起实施中华人民共和国国家标准食品中农药最大残留限量标准（GB2763-2005），该标准中规定了农药甲霜灵在食品中的最大允许残留量。中华人民共和国国家标准甲霜灵在食品中最大残留限量标准种类最高残留限量（MRL），≤，mg/kg国家标准号谷子0.05GB2763-2005黄瓜0.5GB2763-2005葡萄1GB2763-20053.检测方法建立•甲霜灵不稳定，传统的气相色谱法检测困难。Krause在原有检测基础上进行改进，将高效液相色谱法（HPLC）应用于食物样本检测中，此方法普遍用于检测氨基甲酸酯类杀虫剂。虽然HPLC法具有更高的灵敏度，可以精确地对样品中的农药进行定性和定量分析，但此法要求精密复杂的仪器，而且需要专业人员操作，不适合于大批量样品的检测。•胶体金免疫层析诊断技术是在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，具有快速、灵敏、操作简便、成本低、无需专业人员操作等特点，真正达到复杂原理与简易操作的统一；同时具有保存方便，有效期长等特点。•与气相色谱法补充使用，具有灵敏度高、操作简便、检测迅速等特点。主要技术路线4.分课题情况简单汇报•拟解决的关键技术：小分子免疫原的合成、与小分子免疫原抗原决定簇配对单克隆抗体的制备及胶体金研究。•课题完成情况及效果：本课题已成功研制出合成免疫原N2B，进行免疫获得单克隆抗体N2B14E6C10,这一针对甲霜灵抗原决定簇配对的单克隆抗体，亲和力好，效价达到10-9，并成功制成甲霜灵胶体金检测试纸，应用竞争法胶体金检测试纸最低检出量可达0.3mg/kg，达到国标要求。通过比对试验的验证，相关系数r=0.99996，说明方法的可靠性。因此，可以肯定胶体金免疫法在农药、兽药残留限量快速检测技术中，是最有效、最快速、最简便的方法。其优点在于灵敏度高、特异性强、操作简便、快速、常温储存等，是适合于现场检测的一种快速检测方法，是食品安全检测的一种手段，互补现有检测方法各自的优缺点。二、试验研究内容•免疫原合成•抗体制备•胶体金研究•半成品研制及鉴定•成品研制1.免疫原合成•半抗原合成•免疫原合成•免疫原的鉴定•小结（1）半抗原合成•将1.6gNaOH溶于200mL蒸馏水中，并加入10.056g甲霜灵，油浴50℃下搅拌6h，用TLC检测，反应完全；用乙酸乙酯洗涤反应液，弃去酯相；水层用浓盐酸调pH值至1.0左右，析出白色物质；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用无水硫酸钠干燥过夜；抽滤酯相，旋转蒸除溶剂，得到白色固体物质；用正己烷和乙酸乙酯重结晶，抽滤后得到半抗原N2（甲霜灵酸）。（2）免疫原合成•称取0.265g甲霜灵酸，用8mLDMF溶解，加入0.258gDCC和0.125gNHS；用TLC监测反应完全程度，待反应完全后，抽滤反应液，用DMF洗涤两遍；称取2gBSA，用200mL0.2mol/LpH值8.7的硼酸盐缓冲液溶解；将DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室温搅拌过夜，得到甲霜灵免疫原N2B。•先用蒸馏水透析2天，再用生理盐水透析3天，每天换液2次；透析后的溶液于3000r/min离心15min，取上清液于-20℃下冷冻干燥，冻干后分装保存。•同法可将甲霜灵酸连接到鸡卵清蛋白OVA上，合成检测原（N2A）。（3）免疫原的鉴定•紫外扫描从紫外扫描图谱可以看出：N2B在274.5nm出现最大吸收峰，峰值为0.209ABS；BSA在278.0nm出现最大吸收峰，峰值为0.083ABS。甲霜灵人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明显高于BSA在280nm的紫外吸收峰，所以通过紫外扫描可以证明，甲霜灵半抗原成功的连接到了载体蛋白BSA上。•琼脂糖双扩散法鉴定DADT结果显示，抗血清与免疫原（N2B）、BSA、检测原（N2A）均出现反应沉淀线，而与OVA、甲霜灵未产生可见的沉淀线。这说明抗血清中含有甲霜灵抗体和BSA抗体，不与OVA交叉反应，虽然与甲霜灵发生交叉反应（理论上推测），但不形成可见的沉淀线。DADT检测结果表明，N2B合成成功，即N2与BSA间通过化学键结合。（4）小结•本试验通过化学合成法进行甲霜灵免疫原的制备，利用甲霜灵酸结构中的羧基，在适当的偶联剂作用下将其连接到载体蛋白（-BSA）上，制成免疫原。通过紫外检测法、动物免疫试验对甲霜灵免疫原进行鉴定，证实免疫原合成成功。2.抗体制备•单克隆抗体制备•多克隆抗体制备（1）单克隆抗体制备•单克隆抗体制备流程•单克隆抗体特性鉴定•小结单克隆抗体制备流程•用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在无菌条件下取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA间接法从产生的267株阳性杂交瘤中，筛选出对甲霜灵抗原呈阳性反应的杂交瘤11株，注射小鼠185只，制备腹水419mL，纯化得到275.8mg抗体。结果表明：我们成功获得了能识别甲霜灵抗原决定簇的杂交瘤细胞株：N2B14E6C10。单克隆抗体鉴定•①抗体的纯度鉴定从图中可以看出N2B14E6C10在电泳中呈现1条带，纯度大于95%，同时这株抗体分子量与97.4KD蛋白标准品相近。•②间接ELISA法检测抗体活性从左图可以看出，当抗原浓度为0.32ng/mL时，OD450是1.681，大于0.5，因此活性合格。•③间接ELISA法抗体特异性检测由左图可以看出甲霜灵单抗只针对甲霜灵抗原特异，与其它无关抗原不发生反应，具有较好的特异性。•④抗体亲和力的鉴定亲和力：N2B00.20.40.60.811.21.4-5-4-3-2-10Ag:1ug/mLAg:0.5ug/mLAg:0.25ug/mL单抗测得三个Kaff值（M-1）Kaff值（M-1）均值±标准差变异系数（%）N2B14E6C107.41×109（6.72±0.507）×1097.50%6.20×1096.56×109N2B14E6C10抗体亲和力表•用甲霜灵抗原包被直接筛选，结果显示：N2B14E6C10能识别甲霜灵抗原决定簇；经ProteinA柱直接纯化，亚类为IgG1的这株抗体纯度达到95%以上；抗体亲和力常数（6.72±0.507）×109，可以满足用于制备检测试纸的检测线。小结（2）多克隆抗体制备•基本制备过程•多克隆抗体活性鉴定•小结过程：动物免疫多克隆抗体纯化多抗活性鉴定500μg1000μg31.25μggg31.25μggggggg1000μg500μg62.5μg125μg250μg62.5μg125μg250μg0.5mg/mL1mg/mL从左图可以看出，此羊抗属IgG抗体稀释浓度在31.25µg/mL时清晰可见沉淀线，判定此抗体活性合格。多克隆抗体活性鉴定•羊抗鼠多克隆抗体，经活性鉴定合格，可以满足用于制备检测试纸的控制线。小结3.胶体金研究•经过电镜结果分析（同甲萘威），我们可以得出：胶体金颗粒直径在20～30nm之间时，颗粒大小均匀、无聚合与沉淀现象，且灵敏度高，为最佳状态。此时与抗体的结合量为6～12mg，氯金酸与柠檬酸三钠溶液的配比为30mL/18～20mL。4.半成品研制及鉴定•原理•胶体金检测试纸条的制作工艺流程•半成品调试•半成品鉴定•小结•在硝酸纤维素膜上的检测区包被甲霜灵合成免疫原，对照区包被羊抗鼠多克隆抗体。当待测物中有被测的抗原物质（即甲霜灵）时，待测物中的抗原物质就会与标记胶体金的甲霜灵单克隆抗体形成Ag-Ab-Au复合物，复合物不与包被在硝酸纤维素膜上的甲霜灵合成免疫原结合，仅会在控制线处出现一条色带（C线），结果为阳性，说明被检测的样品中农药甲霜灵超标。当待测物质中没有被测的抗原物质时，标记胶体金的甲霜灵单克隆抗体就会与包被在硝酸纤维素膜上的甲霜灵合成免疫原结合，形成Ag-Ab-Au复合物，此时检测线处可看到一条明显色带（T线），因此当检测试纸上可看到两条线（C线和T线）时，结果为阴性，说明被检测的样品中农药甲霜灵未超标。原理胶体金检测试纸条制作工艺流程调试日期数量测试结果结果分析解决方法备注水标准品05.4.108条阴性无梯度，检测1mg/mL和检测水的颜色一样。1.胶体金的浓度高2.膜的浓度高1.降低金的浓度2.降低膜的浓度检测不同浓度的小样8个05.4.118条阴性检测限100μg/mL，敏感度低。1.胶体金的浓度高2.膜的浓度高1.降低金的浓度2.降低膜的浓度检测不同浓度的小样8个05.4.128条阴性检测限1μg/mL，敏感度低。1.胶体金的浓度高2.膜的浓度高1.降低金的浓度2.降低膜的浓度检测不同浓度的小样8个05.4.138条无反应线1.胶体金的浓度低2.膜的浓度低1.提高胶体金的浓度2.提高膜的浓度检测不同浓度的小样15个05.4.148条反应线浅检测限10ng/mL1.胶体金的浓度低2.膜的浓度低1.提高胶体金的浓度2.提高膜的浓度检测不同浓度的小样10个05.4.178条阴性检测限500ng/mL，敏感度低胶体金浓度高降低胶体金的浓度检测不同浓度的小样4个05.4.198条阴性检测限300ng/mL。结果符合要求，测标准品有梯度。进行敏感性，特异性和阳性参考品检测。生产试纸条进行半成品的鉴定05.4.198条阴性检测阳性参考品达300ng/mL结果符合要求，测标准品有梯度。进行敏感性，特异性和阳性参考品检测。生产试纸条进行半成品的鉴定05.4.198条阴性与其它农药均无交叉结果符合要求，测标准品有梯度。进行敏感性，特异性和阳性参考品检测。生产试纸条进行半成品的鉴定甲霜灵竞争法试纸条半成品灵敏度调试•①敏感性鉴定•取甲霜灵竞争法试纸条，依次浸入蒸馏水、浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜灵标准品中，5分钟内各试纸条均可见一条红色的控制线，其中蒸馏水和浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜灵标准品在检测区和控制区均可见一条色带，为阴性；而浓度为300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜灵标准品仅在控制区出现一条色带，为阳性。半成品鉴定图中试纸条从左到右依次是蒸馏水、浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜灵标准品的检测结果。结果分析：甲霜灵竞争法试纸条敏感度可达到300ng/mL；检测标准品有梯度变化，灵敏度高，批间差小，性能稳定。•②阳性参考品符合率鉴定•取甲霜灵竞争法试纸条，依次浸入浓度为300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜灵标准品中，5分钟内各试纸条仅可见一条红色的控制线，为阳性。图中试纸条从左到右依次是浓度为100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜灵标准品的检测结果。结果分析：甲霜灵竞争法试纸条性能稳定，特异性好。•③特异性鉴定•取甲霜灵竞争法试纸条，依次浸入浓度均为100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敌百虫、林丹、绿麦隆、甲基对硫磷、禾草灵、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津样品中，5分钟内各试纸条在检测区和控制区均可见一条色带，为阴性