人工血液代用品

人工血液代用品中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所周虹临床用血需求快速增长输血是临床常用的一种治疗手段。近年来，随着医疗技术的迅猛发展和人民群众健康需求不断提升，医疗机构对血液的需求量呈现快速增长的趋势。临床用血需求量以每年10-15%的速度递增。采血量由800余吨/年上升到3600吨/年。血液供应不足--“季节性缺血”目前临床用血量的99％以上来源于无偿献血。主要依靠街头采血来补充其库容量，受户外环境变化、人群流动规律等因素的影响较大，难以保证血液供应的稳定性。血液供需矛盾突出，尤其是2010年10月份目前昆明、江苏、北京、南京等众多城市集中出现的大面积的“季节性缺血”更是引起了全国性的广泛关注。应急突发事件亟需血液保障战争我军未来的主要战略方向，均难以就地采血，必须依靠后方供血。因此，做好血液的保障至关重要。突发事件美国“9·11”事件时，11日至14日共计采血251,370单位，约为平时的2.8倍。自然灾害汶川和玉树地震时的伤员救治，也充分体现了血液保障的重要性。血液保障的特殊性大规模应急血液保障的问题亟待解决!血液代用品作为药物，能够克服来源受限的不足，实现长期保存，在大规模应急血液保障中具有不可替代的优势。血液自身的特殊性保存期短运输条件苛刻血型配合安全风险……空降兵独立作战医疗保障单元二炮导弹旅独立医疗保障单元陆军步兵师、团两级野战救护所野战医院/机动医疗方舱后方血源及血液代用品运血箱（大型）专用运血车携血箱携血箱携血箱第十九条第（三）项明确：团救护所以后的阶梯实施输血。申领+前送前送“黄金救治时间”——血液代用品（血浆代用品）（血小板代用品）红细胞代用品红细胞代用品氟碳化合物血红蛋白氧载体分子间聚合分子内交联高聚物修饰微囊包裹Hemoglobin-BasedOxygenCarriers,HBOCs•1978年第一代氟碳化合物制品Fluosol-DA20TM用于临床实验，1989年被FDA批准在美国用于冠状动脉术后灌流。•第二代氟碳化合物OxygentTM,已在美国、欧洲和加拿大进入Ⅲ期临床试验。10•血红蛋白氧载体：研究的目的集中在稳定血红蛋白四聚体结构、降低氧亲和力和延长循环时间等几个方面。游离血红蛋白处于二聚体、四聚体的动态平衡中，二聚体具有肾毒性。分子内交联和分子间聚合能够避免解聚。Elmeretal.Resuscitation.2011Sakaietal.JInternMed.2007;263:4-15小于10nm的颗粒具有较高的肾脏滤过率，能渗出血管壁，引起血压升高等副反应。大于10µm的颗粒能够引起毛细血管嵌塞，不适宜过滤除菌。粒径的适宜范围开展临床试验的主要品种化学特性名称商品名研发公司双阿司匹林交联人血红蛋白DCLHbHemAssistBaxter戊二醛聚合人血红蛋白SFH-PPolyHemeNorthfield戊二醛聚合牛血红蛋白HBOC-201HemopureBiopurePEG修饰人血红蛋白MP4HemospanSangart第一代第二代Chenetal.Clinics.2009;64(8):803-13;Elmeretal.Resuscitation.2011理化特性比较理化特性血液第一代第二代氧亲和力（P50）mmHg26~28~5-10血红蛋白含量g/dL13-15~10-15~4粘度cP~5-10~1~2.5-4保存期和保存条件~45天（4℃）1-3年，4℃或室温1年胶体渗透压mmHg252550分子量kDa500~100血管内半衰期31天~18-24h43h氧亲和力↑粘度↑Elmeretal.Resuscitation.2011气体结合-释放能力与游离四聚体血红蛋白、聚合血红蛋白相比，微囊化血红蛋白结合NO和CO、释放O2的速率降低，接近RBCSakaietal.AmJPhysiolHeartCircPhysiol298:H956-H965,2010.代表品种——Hemopure®(HBOC-201)戊二醛聚合牛血红蛋白Hb=13g/dlP50=40mmHgIso-osmotic,inamodifiedlactatedRingerssolutionpH=7.6-7.9Colloid(COP)~26mmHgAverageMolecularWeight=250KD(tetramer3%)Viscosity=2.4centipoisePlasmahalf-life~19hoursEndotoxin0.02EU/mlShelflife3yearsat2-30℃Essentiallyzeropossibilityofdiseasetransmission研发经历1984Biopure公司创立2001Hemopure®在南非上市2009Biopure公司破产，2010被OPKBiotech公司收购1700余例临床应用10年22次临床试验（836例），南非上市（约850例），慈善捐助（54例）HBOCSafetyRiskNoRBC’sSavedLives整形外科手术，贫血（HB8g/dL），伴心动过速、低血压等RBC(n=338)HBOC-201(n=350)40%RBC+HBOC-20160%HBOC-201RBCHBOC-201n338350心脏病变922P=0.0266全部85岁及以上85岁以下HBOC-201RBCHBOC-201RBCHBOC-201RBCn3503381010340328死亡(%)10(2.9%)6(1.8%)5(50%)1(10%)5(1.5%)5(1.5%)P=0.45心脏病变发生情况统计死亡情况统计第十三届国际血液代用品会议July27-29,2011AnesthesiaCenterforCriticalCareResearchMassachusettsGeneralHospitalandHarvardMedicalSchoolBoston,MA(USA)临床前毒性评价在3g/Kg剂量下，未引起猕猴心肌损伤，未发现异常在猪血液置换的模型中，血压短暂性轻度升高；心脏、脑和肾脏等重要器官血流灌注未减少；骨骼肌和肺血管床血管阻力增加；重要器官氧供得到维持或有所增加心脏保护作用在猪的冠脉结扎模型、心绞痛患者球囊导管或PCI患者术中经冠脉给予氧合的HBOC-201，未发现心脏毒性通过心脏泵功能、心电图和心肌缺血的指标检测发现心肌氧供得到维持能够替代血液的氧气运输功能未发现再灌注损伤和心肌功能异常静脉注射HBOC-201，未发现冠脉或微血管收缩心脏保护作用在猪的冠脉结扎模型、心绞痛患者球囊导管或PCI患者术中经冠脉给予氧合的HBOC-201，未发现心脏毒性通过心脏泵功能、心电图和心肌缺血的指标检测发现心肌氧供得到维持能够替代血液的氧气运输功能未发现再灌注损伤和心肌功能异常静脉注射HBOC-201，未发现冠脉或微血管收缩我国，起步于20世纪70年代。在“九五”、“十五”期间，凯正生物工程公司在国家863计划支持下，已开发出PEG-bHb，形成了一套有自主知识产权的中试放大工艺路线，目前己完成Ⅰ期第一阶段临床试验，是我国目前唯一进入临床试验的红细胞代用品。西北大学研究的戊二醛交联猪血红蛋白也已基本完成临床前研究，准备开展临床试验。微囊化血红蛋白（即人工红细胞Artificialredbloodcells,ARBC）。目前被认为是最安全、最有应用前景的红细胞代用品，目前广泛用无毒性的脂质体(liposome)作为成膜材料,但制备脂质体的难点在于脂质体包封率低（游离血红蛋白必须少于0.26-0.72g/L，因此包封率应在99%以上，而普通脂质体类产品包封率在80%以上）、粒径均一性差、产品不稳定。微囊化血红蛋白——一种全新结构的纳米药物载体——Lipodur，将脂质体内、外相改造成凝胶态结构。凝胶态内相降低了传统脂质体液态内相流动性大引发的渗漏、结构不稳定的问题，而外相凝胶态又克服传统脂质体液态外相中，液体流动性大脂质体粒子易发生聚集、融合、沉降等问题。外相凝胶态脂质体中，脂质体粒子镶嵌于凝胶三维结构中，不可能发生聚集、沉降、融合现象。因此，从结构上Lipodur是一稳定体系，解决了传统脂质体物理不稳定等问题。包封率：99%，游离血红蛋白为0，P50值：12.21mmHg，低于人血（26mmHg），说明氧亲和力比人血增高。渗漏实验：血红蛋白微囊与生理盐水混合，4℃保存，90天无血红蛋白渗漏。20%失血大鼠输注，72小时存活率100%。无血尿等异常现象。胶体渗透压：42.8mmHg，高于人血（25mmHg）。肝脾肾心在20ml/kg的剂量下单次给予健康大鼠是安全可靠的。主要脏器的病理切片图1失血性休克大鼠MAP比较050100150BSR30R120R180时间(min)MAP（mmHg）NSRBCLEH图2失血性休克大鼠体温比较303234363840BSR30R120R180时间(min)体温（℃）NSRBCLEH图3失血性休克大鼠血氧饱和度比较60708090100110120BSR30R120R180时间(min)血氧饱和度（%）NSRBCLEH图4失血性休克大鼠呼吸率比较6080100120140BSR30R120R180时间(min)呼吸率（次/分钟）NSRBCLEH图5失血性休克大鼠皮肤微血流值比较020406080100120BSR30R120R180时间(min)微血流值（Pu）NSRBCLEH“人工红细胞”药效学评价-大鼠失血性休克模型现有的血液代用品均侧重于模拟正常红细胞的生理生化功能如携氧功能，大多数研究者没有认识到模拟正常红细胞力学特性和流变学特性的重要性。以往的研究忽略了血红蛋白与膜蛋白之间、膜蛋白与膜脂之间的结构关系，以及这种关系对红细胞具有优良可变型性和流变学性质的贡献。体外重建人工红细胞——确定了体外重建人工红细胞的工艺技术路线和实验方法。通过实验已确定了结构蛋白的分离制备工艺和磷脂纯化工艺，已采用分子装配方法通过结构蛋白的自组装和极性诱导组装的技术实现了结构蛋白与膜磷脂的有效缔和；通过血红蛋白的导入并与膜结构蛋白结合，实现脂质体微囊的形成并在结构蛋白的作用下形成重建人工红细胞形态。重建的红细胞在micro-pipette系统中进行的观察和细胞力学测量，实验结果显示重建红细胞具有双凹碟盘形态，如同正常红细胞一样，而且可以通过控制条件制备获得纳米级工智能尺寸的重建人工红细胞；重建的人工红细胞呈现活跃波动性，其力学特性和细胞表面积/体积比值与正常红细胞极其相似。对重建的人工红细胞进行了一系列基础性实验，其中包括波顿小室实验、渗透压实验、携氧及反复携氧功能实验等。上述实验结果表明：重建的人工红细胞有良好的可变形性，在毛细血管的微循环中不造成栓塞；重建人工红细胞结构稳定性好，有很好的抗低渗功能，在血管中不易破碎；重建的人工红细胞与天然红细胞一样，具有携氧以及反氧功能。H.Erythrocyte(SEM).8000x（1）形态学观察：天然红细胞与重建红细胞膜蛋白原位荧光共聚焦分析天然红细胞重建红细胞绿色荧光为Spectrin,红色荧光为Band3,黄色荧光为重叠图像（2）力学特性与携氧功能红细胞类型弹性模量（10-3dyn/cm）粘性系数（10-4dyn·s/cm）表/体比值重建人工红细胞4.562～7.8920.175～0.3721.475～1.532天然正常红细胞1.120～8.7530.185～0.4521.386～1.436根据Hemisphericalcapmodel(FromChein’stheory)计算糖酐-牛血红蛋白红细胞代用品糖酐－血红蛋白共价化合物含有糖酐（Dextran）与血红蛋白，可同时满足红细胞代用品及血浆代用品的双重功能。由于糖酐在不同pH维持高水溶性，对Hb有稳定作用，冻干的Dx-Hb亦很容易加水后溶解使用。糖酐血红蛋白糖酐-血红蛋白6.糖酐-血红蛋白对肾脏的安全性血红蛋白(Hb)及糖酐-血红蛋白(Dx-Hb)注入前后比对，前者破坏肾脏结构，引致尿液中乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性增加，