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实用病毒学检验技术实用病毒学检验技术REVIEWONPRATICALVIROLOGYASSAYREVIEWONPRATICALVIROLOGYASSAY湖南省食品质量监督检测所湖南省食品质量监督检测所病毒概述病毒概述VirusViruszz非细胞形态、微小，只含非细胞形态、微小，只含RNARNA或或DNADNA，严格活细胞寄生，以复制，严格活细胞寄生，以复制方式增殖方式增殖zz人类传染病中约人类传染病中约80%80%为病毒，为病毒，传染性强流行广，少有特效药物传染性强流行广，少有特效药物zz与肿瘤的发生密切相关与肿瘤的发生密切相关zz比病毒更小的传染因子比病毒更小的传染因子有卫星病毒、有卫星病毒、类病毒类病毒和朊粒等。和朊粒等。朊病毒Æ单纯疱疹ÆHBV感染分布↑AIDS患者Æ病毒的结构、化学组成与功能病毒的结构、化学组成与功能zz基本结构由核心基本结构由核心(Core)(Core)和衣壳和衣壳((CapsidCapsid))组成组成,,核心＋核心＋蛋白质＝核衣壳（蛋白质＝核衣壳（NucleocapsidNucleocapsid））zz有些病毒在衣壳外有一层类脂包膜（有些病毒在衣壳外有一层类脂包膜（EnvelopeEnvelope）表）表面常有不同形状突起，面常有不同形状突起，称刺突（称刺突（SpikeSpike））zz病毒主要成分病毒主要成分为核酸、蛋白质、为核酸、蛋白质、脂类和糖类脂类和糖类病毒感染的检验流程病毒感染的检验流程细胞培养（原代、传代细胞系）鸡胚培养（粘液V、疱疹V、痘类V）动物实验（新生小鼠、乳鼠）标标本本采采集集与与运运送送初步鉴定初步鉴定病毒分离病毒分离血清学血清学最终鉴定最终鉴定Å豚鼠标本的采集和运送标本的采集和运送zz尽早尽早((疾病初期或急性期疾病初期或急性期))采集适当部位的标本采集适当部位的标本zz立即接种或冷藏送检或加立即接种或冷藏送检或加入甘油或二甲亚砜入甘油或二甲亚砜--7070℃℃保存保存zz采双份血清：急性期和恢复期各一份，同时测抗采双份血清：急性期和恢复期各一份，同时测抗体，效价呈体，效价呈44倍以上增高有诊断价值倍以上增高有诊断价值zz烈性病毒严防扩散，烈性病毒严防扩散，专人送检专人送检zz应填写病人详细信息，应填写病人详细信息，便于流行病学调查便于流行病学调查标本处理与接种标本处理与接种zz标本的处理标本的处理：除去标本中的：除去标本中的污染细菌，并将其中的病毒污染细菌，并将其中的病毒释放至细胞外释放至细胞外zz细胞培养细胞培养::原代和次原代和次代细胞培养代细胞培养、二倍体、二倍体细胞细胞、传代细胞系、传代细胞系培养基：培养基：16401640、、DMEMDMEM、、MEMMEM培养瓶、培养板ÆÅ倒置显微镜CO2细胞培养箱Æ常用于病毒分离的细胞常用于病毒分离的细胞非洲绿猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒人单核细胞HIV、HTLV、HHV-6人胚肾、肺细胞腮腺炎病毒、腺病毒恒河猴猕猴肾细胞ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇、RSVHela柯萨奇A、B组、RSVHep-2腺病毒、RSV人胚肺成纤维细胞株CMV、VZV、鼻病毒WI-38、MRC—5腮腺炎病毒、腺病毒传传代代系系VeroHSV、RSV、风疹病毒、轮状病毒、麻疹病毒二倍二倍体体原原代代细细胞胞病毒感染的初步鉴定病毒感染的初步鉴定zz自细胞培养、鸡胚或动物分离出的能稳定传代的自细胞培养、鸡胚或动物分离出的能稳定传代的病原，在确证无细菌、支原体污染后，就可以认病原，在确证无细菌、支原体污染后，就可以认为已分离到病毒。为已分离到病毒。初步鉴定：临床症状、流初步鉴定：临床症状、流行病学、标本来源、行病学、标本来源、易感动物、细胞病易感动物、细胞病变、生物学特征、理变、生物学特征、理化特征等。化特征等。病毒感染的初步鉴定病毒感染的初步鉴定zz细胞病变效应细胞病变效应(Cytopathiceffect(Cytopathiceffect))由病毒增殖引起的细胞改变由病毒增殖引起的细胞改变zz①圆缩、分散、溶解①圆缩、分散、溶解zz②融合成多核巨细胞②融合成多核巨细胞zz③肿胀、颗粒增多、③肿胀、颗粒增多、聚集成葡萄状聚集成葡萄状zz④胞质出现空泡④胞质出现空泡zz⑤胞浆或核内出现⑤胞浆或核内出现嗜酸性或嗜碱性包嗜酸性或嗜碱性包涵体涵体zz⑥培养液⑥培养液pHpH的变化的变化ÅRSV感染后Hela细胞的融合病变嗜酸性病毒包涵体ÆHCMV感染HEL细胞后的巨细胞病变Æ病毒感染的初步鉴定病毒感染的初步鉴定zz蚀斑形成：单层细胞中被病毒感染导致死亡的细蚀斑形成：单层细胞中被病毒感染导致死亡的细胞区叫空斑，一个空斑由一个病毒颗粒感染引起胞区叫空斑，一个空斑由一个病毒颗粒感染引起的。病毒不同则空斑形态和大小不同。的。病毒不同则空斑形态和大小不同。zz干扰现象：病毒间可互相干扰，一种病毒感染细干扰现象：病毒间可互相干扰，一种病毒感染细胞后，可以干扰以后进入的病毒增殖。胞后，可以干扰以后进入的病毒增殖。zz红细胞吸附及抑制试验：红细胞吸附及抑制试验：某些病毒感染的细胞表某些病毒感染的细胞表面含血凝素可与面含血凝素可与RBCRBC吸吸附，加入抗体后可抑制。附，加入抗体后可抑制。病毒感染的初步鉴定病毒感染的初步鉴定zz病毒的大小和形态：可用电子显微镜观察病毒的病毒的大小和形态：可用电子显微镜观察病毒的大小及形态，或用超微过滤法估计病毒颗粒的大大小及形态，或用超微过滤法估计病毒颗粒的大小。小。zz核酸类型鉴别：核酸类型鉴别：55--溴溴--22--脱氧尿苷（脱氧尿苷（BUDRBUDR）可抑）可抑制制DNADNA复制，而对复制，而对RNARNA病毒无作用，利用此特性病毒无作用，利用此特性可判断病毒核酸类型。可判断病毒核酸类型。疱疹病毒烟草病毒病毒感染的初步鉴定病毒感染的初步鉴定zz耐酸试验：耐酸试验：肠道病毒和鼻病毒都是小肠道病毒和鼻病毒都是小RNARNA病毒，病毒，但肠道病毒对酸（但肠道病毒对酸（pH3pH3）耐受，鼻病毒在酸性条）耐受，鼻病毒在酸性条件下易灭活，藉此可区别。件下易灭活，藉此可区别。zz乙醚敏感试验：包膜病毒包膜易被乙醚、氯仿、乙醚敏感试验：包膜病毒包膜易被乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂溶解，而失去感染性，可作脱氧胆酸钠等脂溶剂溶解，而失去感染性，可作为病毒是否具有脂类为病毒是否具有脂类包膜的依据。包膜的依据。病毒感染的最终鉴定病毒感染的最终鉴定在初步鉴定的基础上选择适当的血清学方法在初步鉴定的基础上选择适当的血清学方法对病毒分离株进行最后鉴定，病毒＋已知参考血对病毒分离株进行最后鉴定，病毒＋已知参考血清反应。清反应。zz中和实验：病毒与型特异性抗体进行免疫反应中和实验：病毒与型特异性抗体进行免疫反应后，使之不能吸附于敏感细胞，失去感染能力后，使之不能吸附于敏感细胞，失去感染能力zz补体结合实验：补体结合抗体为补体结合实验：补体结合抗体为IgMIgM，出现早，，出现早，消失快，可用于病毒感染的早期诊断。消失快，可用于病毒感染的早期诊断。病毒感染的最终鉴定病毒感染的最终鉴定zz血凝及血凝抑制试验血凝及血凝抑制试验：病毒或其血凝素在一定：病毒或其血凝素在一定PHPH和和TT可与可与RBCRBC产生血凝，这些性质有重要鉴定产生血凝，这些性质有重要鉴定意义。加入相应的血凝素抗体则可抑制血凝以鉴意义。加入相应的血凝素抗体则可抑制血凝以鉴定型别。定型别。zz免疫荧光抗体技术：出现明显免疫荧光抗体技术：出现明显CPECPE前检查病毒前检查病毒AgAg，以作为早期快速诊断以及无，以作为早期快速诊断以及无CPECPE病毒。特异病毒。特异荧光抗体染色后荧光显微镜观察，判断型别。荧光抗体染色后荧光显微镜观察，判断型别。zz酶免疫技术：酶免疫技术：ELISEELISE病毒感染的快速诊断病毒感染的快速诊断zz传统的单一分离病毒已经发展至病毒血清传统的单一分离病毒已经发展至病毒血清学、分子生物学、电子显微镜等更加敏学、分子生物学、电子显微镜等更加敏感、特异、简便的诊断技术。感、特异、简便的诊断技术。zz病毒感染的快速诊断有利于已有特异药物病毒感染的快速诊断有利于已有特异药物病毒感染的治疗，如疱疹病毒。病毒感染的治疗，如疱疹病毒。zz早期诊断对控制病毒感染十分重要。确诊早期诊断对控制病毒感染十分重要。确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学也病毒感染的病原在监测病毒的流行病学也有重要的意义。有重要的意义。zz形态学、形态学、AgAg检测、核酸、血清学检测、核酸、血清学病毒感染的快速诊断－形态学检查病毒感染的快速诊断－形态学检查zz光镜检查：光镜检查：根据病毒感染细胞内嗜酸性或嗜碱性根据病毒感染细胞内嗜酸性或嗜碱性包涵体的特点辅助判断。包涵体的特点辅助判断。zz电镜检查：电镜检查：感染早期的标本中可直接检出病毒体感染早期的标本中可直接检出病毒体（（HAVHAV、轮状病毒）、轮状病毒）zz方法学评价：直接检测方法学评价：直接检测标本、发现新病毒、直标本、发现新病毒、直观显示病毒，用于检测观显示病毒，用于检测极难分离的病毒。但仪极难分离的病毒。但仪器昂贵，技术高，不能器昂贵，技术高，不能鉴别病毒的血清型。鉴别病毒的血清型。电子显微镜快速诊断－抗原检测快速诊断－抗原检测zz免疫学方法检测标本中特异性抗原，可早期诊断免疫学方法检测标本中特异性抗原，可早期诊断病毒感染。用单克隆抗体检测病毒抗原，具有良病毒感染。用单克隆抗体检测病毒抗原，具有良好的特异性。好的特异性。zz常用方法：组织或胞内的病毒成常用方法：组织或胞内的病毒成分可用免疫荧光染色、免疫酶染分可用免疫荧光染色、免疫酶染色等；胞外的或可溶性的病毒成色等；胞外的或可溶性的病毒成分可用凝集试验、酶联免疫分可用凝集试验、酶联免疫吸附试验、放免、免疫渗滤吸附试验、放免、免疫渗滤层析试验层析试验（胶体金）等。（胶体金）等。快速诊断－抗原检测快速诊断－抗原检测zz免疫荧光：荧光素标记的抗体直接或间接测定病免疫荧光：荧光素标记的抗体直接或间接测定病毒抗原毒抗原zz免疫过氧化物酶技术免疫过氧化物酶技术：偶联物是辣根过氧化物酶：偶联物是辣根过氧化物酶zz酶免疫酶免疫zz乳胶凝集试验乳胶凝集试验zz放射免疫技术（放射免疫技术（RIARIA））zz发光免疫技术发光免疫技术zz金标免疫技术等金标免疫技术等SARS病毒的免疫荧光染色检测快速诊断－核酸检测快速诊断－核酸检测zz斑点杂交法斑点杂交法（（DotblothybridizationDotblothybridization）：）：大多数病毒核酸和大多数病毒核酸和PCRPCR产物产物zz转印杂交：转印杂交：SouthernSouthern、、NorthernNorthernzz原位杂交：原位杂交：胞内病毒检测和定位。胞内病毒检测和定位。zz固相杂交技术：固相杂交技术：核酸修核酸修饰后包被微孔板，加入待测的核酸序列和标记探饰后包被微孔板，加入待测的核酸序列和标记探针。针。zz聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）：特异、敏感）：特异、敏感zzRTRT--PCR,PCR,RealTimeRealTimePCRPCR快速诊断－血清学诊断快速诊断－血清学诊断zz中和试验、补体结合、中和试验、补体结合、RBCRBC凝集及凝集抑制、红凝集及凝集抑制、红细胞吸附和吸附抑制试验、免疫荧光技术、免疫细胞吸附和吸附抑制试验、免疫荧光技术、免疫酶染色、酶染色、ELISAELISA、、WesternblotWesternblot、化学发光、时间、化学发光、时间分辨免疫荧光、荧光偏振、胶体金等属血清学范分辨免疫荧光、荧光偏振、胶体金等属血清学范畴。畴。Å垂直电泳仪Westernblot电泳图Æ病毒检验的结果评价病毒检验的结果评价zz通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据，通过实验手段，从标本中获得有关病毒感染的证据，从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病从而确定病毒感染和临床疾病之间的因果关系，是病毒实验诊断的目标。毒实