聚酰胺柱层析

聚酰胺柱层析目录•什么是聚酰胺?•分离原理•前处理•操作步骤•聚酰胺应用中的问题1.什么是聚酰胺•聚酰胺(Polyamide)是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66。•聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。2.分离原理•2.1吸附机理•聚酰胺是一类结构中含有重复单位酰胺键(-CO-NH-)的高分子聚合物，酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷，以静电引力形成吸附溶液中的阴离子，故可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基的化合物形成氢键而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。2.分离原理CH2CCH2CH2CH2CH2CH2COCH2NOHCH2NHCH2CCH2CH2CH2CH2NCOCH2OHNHOOOH移动相固定相2.分离原理•吸附规律①形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。②易形成分子内氢键者在聚酰胺上的吸附相应减弱。③分子中芳香化程度越高，则吸附性越强；反之，则减弱。④聚酰胺与物质的氢键缔合能力在水中最强，在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。⑤强酸或强碱均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合。2.分离原理•2.2分离机理•2.2.1“氢键吸附”学说•溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合的能力越强,则聚酰胺对这两种化合物的吸附作用将越弱。聚酰胺层析柱即是利用此性质对各种植物中黄酮、茶多酚等进行吸附、洗脱而分离的。2.分离原理•2.2.2“双重层析”理论•当用极性流动相(含水溶剂系统)洗脱时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为类似反相分配层析，当用有机溶剂洗脱时，聚酰胺作为极性固定相，其层析行为类似正相分配层析。但固定相(吸附剂)的极性是由其本身结构及性质决定的，不应随洗脱液的改变而改变，况且聚酰胺层析属于吸附层析，不是分配层析。因此，“双重层析理论”也没有揭示出产生这两种相反现象的根本原因。2.分离原理•2.3洗脱机理•聚酰胺分子中有极性酰胺基团和非极性的脂肪键。作为一个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂(如水、乙醇、丙酮等)时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为类似反相分配层析，极性较大的吸附物易被洗脱。随着洗脱剂极性降低，极性较小的化合物可相继被洗脱下来。3.前处理•3.1新买的聚酰胺取聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3-4倍体积的90-95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2-2.5倍体积5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用。3.前处理•3.2用过的聚酰胺一般用5%NaOH水溶液洗脱，洗至NaOH水溶液颜色极淡为止。有时因某些鞣质与聚酰胺又不可逆吸附，用NaOH水溶液很难洗脱，可用5%NaOH在柱中浸泡，每天将柱中的NaOH水溶液放出一次，并加入新的5%NaOH水溶液，这样浸泡一周后，鞣质可基本洗脱完。然后用蒸馏水洗脱至pH8-9，再用2倍量的10%醋酸水溶液洗脱，最后蒸馏水洗脱至pH中性，重复使用。4.操作步骤•4.1装柱：一般将颗粒状聚酰胺混悬于水中，使其充分膨胀，然后装柱，让聚酰胺自由沉降；当用非极性溶剂系统时候，则用组分中低级性的溶剂装柱。若以氯仿装柱，因其比重较大，使聚酰胺粉浮在上面，加样时应将柱底端的氯仿层放出，并立即加样，加样后顶端以棉花塞紧，在层析关闭时，应将顶端的多余氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层析带。4.操作步骤•4.2上样：一般每100ml聚酰胺上样1.5-2.5g，可根据具体情况适当增加或减少。若利用聚酰胺除去鞣质，样品上柱量可大大增加，通常观察鞣质在柱上形成的橙红色色带的移动，当样品加至该色带移至柱的近底端时，停止加样。样品先用洗脱溶剂溶解，浓度为20%-30%。水溶性化合物直接上样；若提取物水溶性不好，则用挥发性有机溶媒溶解、拌适量聚酰胺、挥干或减压蒸干、干法装入柱顶。4.操作步骤•4.3洗脱：聚酰胺层析的洗脱剂常采用水－乙醇（10％、30％、50％、70％、95％），氯仿－甲醇（19:1，10:1，5:1，2:1，1:1）依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采用3.5％氨水洗脱。洗脱剂的更换，一般根据流出液的颜色，当颜色变为很淡时更换下一种溶剂，并以适当体积分瓶收集，分瓶浓缩。各瓶浓缩液以聚酰胺薄膜层析检查其成分，成分相同者合并。再进入下一步纯化。4.操作步骤•4.4找到最佳吸附比：先小量试验找到最佳吸附比。•4.5放大：根据小试及最佳吸附比进行放大试验。•4.6聚酰胺的回收：使用过的聚酰胺一般用5%氢氧化钠溶液洗涤，然后水洗，再用10%醋酸液洗，然后用蒸馏水洗至中性，即可。有文献报道聚酰胺可反复使用上千次。5.聚酰胺应用中的问题•5.1冲洗速度慢。可预先用筛筛去细粉或与硅藻土(1:2)混合物装柱，以及加压或减压冲洗等法予以克服。由于纯聚酰胺用于柱层析固定相存在滤水性差、单位质量吸附量小、有小分子夹带的问题，对聚酰胺柱进行了改进。将聚酰胺涂装在硅藻土上，制成的改性聚酰胺柱，改善了滤水性，提高了单位质量聚酰胺的吸附量，消除了小分子夹带问题。5.聚酰胺应用中的问题•5.2当含甲醇的溶剂洗脱时，往往所得到的黄酮类化合物中含有低分子量的聚酰胺。故可用50%甲醇水溶液预先洗涤除去。