1.2-基因工程的基本操作程序

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姐的心里不缺人@不死唐三藏-高调艿是姐的风格、黑的不是社会,是心。劳资就是不淑女#奈何桥上唱征服飞车妹子雄起无敌硬妹拒绝狗友媳妇为王°姐我输的起。你若离去丶巴掌扇去*我天生傲骨怎能服输哥不会英文,只会拼音一枪崩了你。帆布鞋也比你高跟鞋优雅、未来学霸°命你!我素学渣我怕谁°甩我者亡i婷大爷@〔伤我者亡〕坟地里唱嗨歌^别碰我心#欧霸!时贱去尼玛の淑女少年就要狂我要当学霸@、我行我素。宁无爱哥丶看破繁华说我拽你能奈我何@爱滚哪滚哪!你快滚!伤我你不配&你拿什么资本跟我傲!|你特么算什么东西°不过如此▁你已被我out冥花有主゜ゝ绝√诱惑矫揉造作无需挽留…莫犯贱。_爱你等于作孽穷的只有爱、sorry请滚。气势比天高大陆男神劳资是个好菇凉国产好姑娘*Rollforme给我滚▕国际帅锅丶直觉不是理由抱歉。nl、不配°〃若离,必弃。男人拽照样甩变态人士@强迫症患者@补刀团团长'你柔弱给谁看゛莫装纯午夜埋葬者╮霸道姐骚娘们劳资爱上尼玛了姐不缺爱1.2基因工程的基本操作程序转基因抗虫棉花转入苏云金杆菌的一个抗虫基因,是中国目前最主要的转基因作物。•基因工程培育抗虫棉的简要过程:普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)•上述培育抗虫棉的关键步骤有哪些?关键步骤一:抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来。通过观察抗虫棉的培育过程,你认为关键的步骤是什么?关键步骤三:抗虫基因导入受体(棉花)细胞。关键步骤二:抗虫基因与运载体DNA连接。基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因:如:与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法:1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成1.从基因文库中获取目的基因1.基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2.基因文库的种类:基因组文库:含有一种生物的全部基因部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因,如:cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA基因的结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。:编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区②调控遗传信息表达,上游的RNA聚合酶结合位点:基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游编码区非编码区外显子:能编码蛋白质的序列内含子:不能编码蛋白质的序列:有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。与RNA聚合酶结合位点基因结构基因的结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核cDNA文库缺少哪些序列?真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子基因组DNA文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段)基因多少物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以2.利用PCR技术扩增目的基因1概念:PCR全称为多聚酶链式反应,是一项在生物体外迅速扩增特定DNA片段的技术。短时间内能够大量扩增目的基因。2原理:DNA复制反应液(原料):模板DNA;四种脱氧核苷酸;热稳定DNA聚合酶(Taq酶);DNA引物。DNA引物是一段基因序列,作为核苷酸聚合作用的起始点3前提:已获知目的基因的核苷酸序列。PCR技术的操作过程a、DNA变性(90℃-95℃):双链DNA模板在热作用下,_____断裂,形成________b、退火(复性55℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部________。c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤:每重复一次,目的基因增加___倍一回忆:DNA复制的基本过程有哪些?双链单链合成子链解旋酶聚合酶第一步:在数据库中下载目的基因序列,设计引物:F:5’-TAGAACAGGCTCCTCTAG–3’R:5’-TTAGATACCCCACTATGC-3’第二步:配制反应溶液:模板DNA;四种脱氧核苷酸;热稳定DNA聚合酶;DNA引物第三步:PCR反应:2.利用PCR技术扩增目的基因实例:扩增目的基因94℃预变性5min94℃变性30s51℃退火30s72℃延伸30s72℃终延伸10min35个循环PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等阅读选修一P58课题23.人工合成法在基因较小,核苷酸序列已知的情况下,可以利用DNA合成仪人工合成反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库:含有一种生物的全部基因部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因,如:cDNA文库随堂练辨析题:1、所有的目的基因都可以从基因文库中获取。2、Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。3、基因表达载体中含有启动子和密码子。4、用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。5、PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。1、错2、错3、错4、对5、错随堂练下列有关PCR过程的叙述中不正确的是()A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键,也可利用解旋酶实现B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D.PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高选C6.如图所示为一种限制酶切割DNA分子的示意图,请据图回答:(1)这种限制酶的切点是,形成两个末端,这两个末端的特点是.(2)图中DNA分子被该种限制酶切割后形成的两个末端是.(3)如果G发生突变,(填“可能”或“不可能”)导致限制酶不能识别切割位点.P44.限制酶可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列,如图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和BglⅡ的识别序列和切割位点,切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是()A.BamHⅠ和EcoRⅠB.BamHⅠ和HindⅢC.BamHⅠ和BglⅡD.EcoRⅠ和HindⅢP61基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成:复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因表达载体启动子:位于基因的首端的一段特殊的DNA片断,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将有目的基因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子(重组质粒)同一种一个切口两个末端基因表达载体1.为什么要有“表达载体”的构建这一步骤?2.一个基因表达载体有哪些结构组成的呢?3.什么是启动子、终止子?它们的作用是什么呢4.标记基因的作用是什么呢?注意:①载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶:既用到限制酶切割载体,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞,必需以表达载体的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞1转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2导入不同受体细胞:1、导入植物细胞2、导入动物细胞3、导入微生物细胞……1、目的基因导入植物细胞的方法(1)农杆菌转化法①农杆菌特点:易感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力。②原理:Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞,并整合到受体细胞染色体的DNA上。三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达③过程:1、目的基因导入植物细胞的方法(2)基因枪法:目的基因导入单子叶植物细胞①操作方法:利用压缩气体产生的动力,将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。②钨粉粒子和金粉粒子,粒子的直径一般在0.6~4um。③适用:单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方法(3)花粉管通道法:将目的基因导入植物细胞①操作方法:在植物花受粉后,花粉形成花粉管还末愈合前期,剪去柱头,然后,滴入DNA(含的基因)使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞②特点:十分简便经济。③例:转基因抗虫棉2、将目的基因导入动物细胞①方法:显微注射法①程序目的基因表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞①微生物作受体细胞原因:繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少②常用菌:大肠杆菌③常用法:Ca2+处理获得感受态细胞④过程:Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞感受态细胞吸收DNA表达载体与感受态细胞混合小结:将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后,全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗?1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后,是否都能稳定维持和表达?不一定,需要检测1、鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N(1)检测转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