gus基因检测

gus基因PCR反应程序：94℃预变性5min94℃变性1min58℃退火1min30个循环72℃延伸2min72℃延伸7mingus基因引物序列为：5’GCTATACGCCTTTGAAGCC3’和5’TTGACTGCCTCTTCGCTGTA3’GUS染色母液:X-Gluc由DMSO溶解，贮存浓度为l0mg/mL,于-20°C保存。GUS染液:500mg/LX-Gluc,0.1mol/LK3Fe(CN)6，0.lmol/LK4Fe(CN)6，0.0lmol/L，Na2-EDTA,1%TritonX-100(V/V),0.14mol/LPBS缓冲液(pH7.0)。试剂名称母液浓度配置方法工作液浓度工作液配置方法(mL)X-Gluc,l0mg/mL20mgX-Gluc溶于2mlDMSO500mg/L50K3Fe(CN)6，1mol/L32.9424g—100ml水0.1mol/L100K4Fe(CN)61mol/L42.239g—100ml水0.lmol/L100Na2-EDTA0.5mol/L18.61g—100ml水调pH为80.0lmol/L200TritonX-10010%取10mlTritonX-100用水定容至100ml1%10PBS缓冲液10×0.01mol/L0.1mol/L2501000mL0.5MNa2HPO4配制方法：将17.907gNa2HPO4溶于水，定容至100ml。.5MNaH2PO4的配制方法：将7.800gNaH2PO4溶于水，定容至100ml这是1ml的配方体系：终浓度药品分子量体积0.5MNa2EDTA20ulTritonX-1001ul1M磷酸钠缓冲液（PH7.0）100ul0.1MK3Fe(CN)65ul0.1MK4Fe(CN)65ul10mg/mlX-Gulc200ul去离子水或无菌水669ul染液配方0.05M磷酸缓冲液4.48ml5mM铁氰化钾0.05ml,5mM亚铁氰化钾0.05ml，Triton-1000.01ml，水4.64ml，X-Gluc先溶于0.05mlDMF中，终浓度为0.5mg/ml37度染色过夜1.2染色步骤1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。4)记录：在体视显微镜下拍照记录。2．GUS报导基因的定量检测GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。2.1试剂配制1)1mol/LNa2HPO4溶液：35.814gNa2HPO4溶于100ml水。2)1mol/LNaH2PO4溶液：15.601gNaH2PO4溶于100ml水。3)0.1M磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/LNa2HPO4取5.77ml，1mol/LNaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。4)10％SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10gSDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。5)0.5MEDTA(PH8.0)：在80ml水中加入18.61gNa2EDTA•2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。6)GUS酶提取液：0.1M磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10%SDS取1ml；0.5MEDTA(PH8.0)取2ml；TritonX-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。7)MUG底物：称8.8mgMUG，溶于10mlGUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。