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Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac表达结构后可以产生重组杆粒。*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。Vector特点参考pFastBacTM1高水平表达的强AcMNPV聚乙烯（PH）启动子用于简单克隆的大量克隆位点Anderon1996pFastBacTMHT高水平表达的聚乙烯启动子；N-末端含有6XHis，可以用来纯化重组蛋白，并可用TEV蛋白酶切去；提供3个阅读框Polayes1996pFastBacTMDual两个强启动子（PH和p10）Harris和Polaye1997可以同时表达两种蛋白；两个大的克隆位点指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBacTM供体质粒的选择2、转化pFastBacTM结构到最高效的DH10BacTM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplifyandtiter）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。Bac-to-Bac表达系统表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBacTM菌株。基于pFastBacTM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7*第二个主要结构是Ecoli的DH10BacTM品系，用来作为pFastBacTM菌株的宿主。DH10BacTM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBacTM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBacTM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10BacEcoli中包括：*一个低拷贝的微型F复制子*卡那霉素的抗性标记*一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒EcoliDH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal或X-gal和诱导剂IPTG存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10BacEcoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7转化功能。图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达实验轮廓：流程：下图揭示了表达目的基因的一般步骤1、pFastBacdonor质粒（步骤：目的基因的克隆）得到2、pFastBac重组体（转化至DN10Bac细胞（含有杆粒和helper））得到3、含有重组杆粒的Ecoli细胞（重新划线）得到4、验证过的含有重组杆粒的Ecoli细胞（过夜培养，分离重组杆粒DNA）得到5、重组杆粒DNA（使用Cellfectin试剂感染细胞）得到6、P1重组杆状病毒株（＞106pfu/ml）（感染昆虫细胞扩增病毒）得到7、P2重组杆状病毒株（＞107pfu/ml）（滴定感染昆虫细胞）得到8、蛋白的表达培养昆虫细胞：一般指导：介绍：对于您的杆状病毒转移菌，我们推荐使用Sf9和Sf21昆虫细胞作为宿主。在开始你的转化试验和表达之前，确定你有收获的Sf9和Sf21，并将其冻存。使用无血清的介质：昆虫细胞可能在无血清的条件下收获。我们推荐使用Sf900ⅡSFM。Sf900ⅡSFM对于维持Sf9和Sf21以及对于大规模生产重组蛋白，都是无蛋白的最优的介质。昆虫细胞培养参考指导：维持和传代昆虫细胞在贴壁和悬浮条件下冷冻细胞使用无血清的介质按比例增加细胞产量一般指导：昆虫细胞对于环境很敏感，此外化学和营养因素，物理因素都可以影响昆虫细胞的成长。需要优化以得到最大产量。考虑以下培养条件：*温度：细胞的感染和成长的最适合范围是27-28度*PH：对于许多培养系统6.1-6.4时合适的范围。Sf900ⅡSFM在此范围内支持一般的空气和开盖培养*同渗重摩：鳞翅类细胞使用介质的最优同渗重摩是345-380mOsm/kg*通风：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%*剪切力：悬浮培养产生机械剪切力。生长的昆虫细胞在含有血清的介质中（10%-20%FBS），对于细胞的剪切力一般会得到足够的保护。如果你的细胞在无血清条件下生长，加入剪切力保护剂例如PluronicF-68。注意：在Sf900ⅡSFM中生长的细胞不需要加入剪切力保护剂。转染的细胞：你需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。产生重组的pFastBacTM菌株（Vector）一般信息：介绍：为了产生包含目的基因的重组质粒，使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，你需要使用限制酶消化和连接，将你的目的基因克隆进入pFastBac菌的其中一种。一般分子生物学技术：为了帮助限制酶消化和连接DNA的序列，需要其他一般的分子生物学技术扩增和保存质粒：pFastBac菌种和他的相应的表达对照质粒包含氨苄青霉素抗性基因，可以使用Ecoli进行Amp筛选。为了扩增和保存pFastBac和pFastBac对照质粒，使用以下方法：1、使用载体株系感染一个recA,endAEcoli株，例如Top10，DH10B或者DH5α2、在含有100ug/mlAmp的LB琼脂糖平板选择转化株。3、选择含有质粒的转化子制备甘油菌以便长期保存克隆进入pFastBacTM1介绍：为了帮助你设计策略克隆你的目的基因进入pFastBacTM1，参考以下建议和表格克隆考虑事项：pFastBacTM1菌株是非融合菌株（无融合标签）。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有：*一个ATG起始密码子用于转录起始*一个终止密码子。注意：终止密码子包含在所有三个阅读框中的多克隆位点中注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。pFastBacTM1的多克隆位点：下图是pFastBacTM1的多克隆位点。限制位点标出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子下划线表示。pFastBacTM1的全序列可以从网站下载。pFastBacTM1的图谱和描述见后缀克隆进入pFastBacTMHTA，B，C介绍：pFastBacTMHT载体由三个读码框（A，B，C）提供的多克隆位点从而实现克隆目的基因，并且在N端带有6XHis。克隆：pFastBacTMHT菌株是融合菌株。为了保证表达重组蛋白，你必须：*克隆你的基因要带有ATG，位于4050-4052碱基对间。这个将会产生融合表达，带有6XHis标签，可以用TEV切除*你的插入要含有终止密码注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测pFastBacTMHTA的多克隆位点：下图是pFastBacTMHTA的多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。pFastBacTMHTB的多克隆位点：下图是pFastBacTMHTA的多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷酸显示出的是易变区域。pFastBacTMHTC的多克隆位点：下图是pFastBacTMHTA的多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷酸显示出的是易变区域。注意pFastBacTMHTC在XbaⅠ位点内有一个终止密码子，他在N端标签框内。确定你的基因的5`端是在XbaⅠ位点上游开始。克隆进入pFastBacTMDual介绍：pFastBacTMDual包含两个多克隆位点，可以同时表达两个异源基因，一个通过PH启动子控制，另一个通过P10启动子控制。参见下列建议以便有助于你的基因克隆克隆事项：pFastBacTMDual是一个非融合载体。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有以下两点*一个ATG起始密码子*如果你不使用多克隆位点中的终止密码子，就必须要有一个终止密码子注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。对于插入克隆上游的聚乙烯启动子，注意到蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。PH启动子下游的多克隆位点：下图是pFastBacTMDual中PH启动子下游的多克隆位点的图示。限制性位点标记出来显示了实际的切刻位点。潜在的终止密码子有下划线标出。P10启动子下游的多克隆位点：下图是pFastBacTMDual的AcMNPVp10启动子下游的多克隆位点。限制性位点标记出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子标记下划线。转化和分析介绍：如果你已经完成了你的连接反应，你就要准备把你的pFastBacTM结构转化进Ecoli了。很多Ecoli宿主菌和转化程序都是可以使用的。一般推荐转化Ecoli和分析转化在下面列出Ecoli宿主：一旦你把你的插入序列克隆进入了pFastBacTM，你需要转化连接反应到Ecoli，并选择优Amp抗性的转化株。你可以使用任何recA，endAEcoli菌。包括Top10，DH10B或者DH5α进行转化。不要转化连接反应进入DH10Bac细胞。注意TOP10和DH10B感受态细胞可以从Invitrogen得到转化方法：