非小细胞肺癌的主要分子标志物

非小细胞肺癌的主要分子标志物张绪超吴一龙教授广东省医学科学院&广东省人民医院广东省肺癌研究所华南临床基因检测中心2009-11-24内容•基因检测主要意义：诊断、预后、预测•现状：已经开展及潜在的基因检测–肺癌关键信号通路上的分子变异–EGFR通路、KRAS–多基因检测•基因检测的质量管理及注意事项•小结诊断：反映个体是否处于疾病状态或患病基因携带状态。预后：反映肿瘤对个体转归的效应、疾病的自然过程，与干预手段无关。生物标志物预测：反映药物等干预手段对肿瘤病灶及进展的效应。非小细胞肺癌的关键信号途径1.DNA损伤修复:NER,MMR2.细胞周期3.生长因子信号途径•EGFR•IGFR•cMET•ALK•…核酸切除修复途径•ERCC1：–在早期患者：qRT-PCR或IHC高表达,生存预后好(94.6mvs35.5m,p=0.01,bySimon,etal.；HR0.66,p=0.009,IALT-Biotrial)，而RafaelRosell报告qRT-PCR高表达与不良预后相关–在晚期患者：qRT-PCR高表达，不良预测(HR0.32,p=0.005,byLordRVetal.)；在IALT试验中证实低表达能够从化疗获得生存获益（IHC-ptsHR0.65,p=0.002;inIHC+pts,HR1.14）–ERCC1与铂类化疗有明确的交互作用，即能预测化疗疗效。Q:whichisbetter,qRT-PCRorIHC?DNA损伤修复途径•RRM1：早期术后高表达，好的DFS。晚期低表达，化疗生存获益（13.7mvs3.6mbyRoselland13.6mbySimonG）•BRCA1：高表达，不良生存预后（qRT-PCRbyRosell，HR1.98,p=0.02)；从抗微管类药物获益，对铂类耐药。细胞周期调节蛋白•TP53：–Meta分析bySteels，2001•IHC:HR1.25(95%CI1.09-1.43)•Genemutation:HR1.65(1.35-2.00)–JBR.10trial(辅助Cis+Vinorelbine对比观察)•IHC–52%inobservationgroup:HR1.89,95%CI1.07-3.34,p=0.03–Highlevel,benefitfromchemo:HR0.54,p=0.02–SignificantinteractionbetweenChemoandTP53(p=0.02)•Mutation(exons5-9)–Inobservationgroup,nosurvivaldifferenceinmTP53pts–mTP53+veptsnotbenefitfromchemo–总的来说,TP53表达是不良预后因子，但是化疗的好的预测因子。细胞周期调节蛋白•Beta-tubulinclassIII：–IHC:高表达，不良PFS及OS（JBR.10，HR1.52,p=0.03and1.39,p=0.08)–qRT-PCR:低表达，对paclitaxel+carboplatin敏感，但对vinorelbine+cisplatin不敏感–需要进一步验证EGFR信号途径：蛋白表达、拷贝数、突变？•EGFR蛋白表达:–40-80%NSCLC，是个弱的预后和预测因子（BR.21andISEL）•EGFR拷贝数变化：–BR.21和ISEL:高CN与不良生存预后相关，但能从TKI获益–高拷贝能从chemo+cetuximab获益byHirschF.但BMS-099试验结果相反–INTEREST:高拷贝不能预测RR及总生存获益，但与好的PFS相关.–IPASS:EGFR突变阴性、高拷贝患者不能从TKI获益–总的来说,EGFR拷贝数在不同条件下预测价值不一，需要进一步验证。1CappuzzoF,etal.JNatlCancerInst2005;97(9):643–55DisomyTrisomyPolysomyGeneamplificationEGFRFISHnegativeEGFRFISHpositivefrom、KRAS突变与肺癌：---均是lungcarcinoma中突变频率最高的基因之一肺癌中EGFR基因突变热点EGFR突变：Exons18、19、20、21AA.Subst.ComplexMuts.Indels..exon18:G719X点突变exon19:E746–A750等缺失exon20:插入、点突变T790M等exon21：L858R肺腺癌中的EGFR突变谱Sharma,NatRevCancer,2007NotallEGFRmutationsarecreatedequal!敏感突变耐药突变•EGFR突变–2004,肺癌EGFR突变与EGFRTKI敏感性相关–EGFR突变患者生存更长(8.3mvs3.3minBR.21)–在BR.21和ISEL中,mEGFR患者有更好的反应和生存获益–在IPASS中•mEGFR+ve患者更好的客观反应率（43%vs32.2%）及更好的PFS(HR0.74,p0.0001)•mEGFR–ve患者中，使用TKI较chemo有较差的PFS(p0.0001)–NEJGSG002研究：mEGFR+ve患者有更好的ORR及PFS（TKIvsChemo,74%vs29%,317dvs166d,p0.001)–…EGFR突变是好的预后因子，也是使用TKI的疗效预测因子。(ApprovedbyFDAandEMEA)Exons2、3(codons12、13、61)肺癌中KRAS基因突变热点•KRAS突变–突变热点：第12、13及61密码子（exon2、exon3）–Meta-analysis:mKRAS是不良预后因子(ByHuncharekMetal.)–JBR.10:•mRAS–ve患者能从化疗获益HR0.69,p=0.03•mRAS+ve患者不能获益HR0.95,p=0.87•Nosignificantinteraction,p=0.29–Tribute:mKRAS+ve患者不能从Chemo+Tarceva方案获益(HR1.9,p=0.03)–SATURN:KRAS不是二线治疗使用TKI的预测因子–mKRAS患者对EGFRTKI是denovo耐药的总之,KRAS突变是不良预后因子及对化疗的不良预测因子。KRAS突变是肺癌对TKI原发耐药的机制之一。多基因生物标志物（signature）基因表达谱变异•分子分型:diagnostics,prognostics,“theranostics”?•I期非小细胞肺癌的预后和预测–MetagenemodelbyAnilPottiatDukeUniv.–50-genesignaturebyBeeretal.NatMed2002;8:816–824–3-genesignaturebyGordonetal.CancerEpidemiolBiomarkersRev2003;12:905–910.–5-genesignature(DUSP6,MMD,STAT1,ERBB3,andLCK)byHYChen,NEJM,2007–64-genesignaturebyYanLu,etal.PLOSMedicine,2006……•DukeUniversity:“Meta-gene”模型可筛选早期肺癌术后高危复发患者–metagenemodels(5~26genes):准确率达75%～90％•CALGB30506临床试验:观察辅助化疗对于Metagene模型筛选的高危术后患者的生存改善情况GOODBADmetagene-79model:19genesBUSpinoutAllegroDxtoLaunchArray-BasedLungCancerTestThisYearJanuary05,2010AllegroDiagnosticslaterthisyearplanstobeginmarketingamicroarray-basedtestforearly-stagelungcancer.FromaCLIAperspective,weanticipatebeingabletoofferBronchoGenin2010,Rippysaid.It'snotentirelyclearifwewillgetitclearedthroughFDAasakit;wemayofferitasanFDA-clearedservicethroughthelabinstead,hesaid.BronchoGen,itsflagshiptest,isan80-genebiomarkerassaythatcandetectandruleoutthepresenceoflungcancerusinghistologicallynormallarge-airwayepithelialcellsobtainedatbronchoscopyfromsmokerssuspectedtohavethedisease.LungExpressDxisa15-gene-expression-basedassaythatclassifiespatientsintohigh-andlow-riskprognosticgroupsbaseduponthemolecularprofileofaparticularpatient’stumor.N=112,splittedintotrainingandvalidationsetFive-microRNAsignature:hsa-miR-221,hsa-miR-let-7a,hsa-miR-137,hsa-miR-372,hsa-miR-182*microRNA表达谱变异StageINSCLCs:51relapsedwithin40mvs116controlsMethylationpatternsofP16,CDH13,APCandRASSF1Aindependentlyassociatedwithrecurrence.OR:15.5~25.25TrainingcohortValidationcohortCombinedcohorts甲基化谱变异吴一龙教授课题组工作广东省肺癌研究所、华南临床基因检测中心200805广东省编办发文正式成立“广东省肺癌研究所”200911挂牌成立“华南临床基因检测中心”生物标志物检测技术技术方法敏感性Directsequencing10-20%PCR-RFLP/SCCPN/AdHPLC/HRMA3-12%突变基因融合RT-PCR、FISH、PCR-sequencing拷贝数FISH、qPCR、aCGH甲基化mRNAsignaturemicroRNAsignatureRealtimePCR--TaqMan--PNA-LNAclamp--ARMS10%1%1%MSP-sequencing、芯片技术基因表达谱芯片、qRT-PCRmiRNA表达谱芯片、qRT-PCRdelE746-A750delE746-T751insAdelL747-T751delE746-A750L861QA871GG719VG719CL858RWildtypeSenseAnti-senseEGFRexons18~21KRASexon2BeforepurificationAfterpurificationPCREGFR突变检测：测序法BigDye3.1标记纯化•PCR测序技术特点–判读直观–高通量–成本相对低–可以发现未知变异早期肺癌术后复发：5-genesignature早期肺癌生存预后：5-genesignatureRecurrenceofGeneModel05001000150020002500050100150HighRiskLowRiskP-value=0.032HR=2.895%CI(1.09,7.18)TimetoRe