高效液相色谱定性定量分析方法

高效液相色谱定性定量分析方法高效液相色谱定性定量分析方法高效液相色谱定性定量分析方法高效液相色谱定性定量分析方法郭瑞臣山东大学齐鲁医院临床药理研究所2009-8-26色谱定性定量分析色谱定性定量分析色谱定性定量分析色谱定性定量分析`色谱分析的目的对未知组分进行定性分析对已知组分进行定量分析`根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰在检测器上的响应强度，对该谱峰初步定性和定量分析定性分析定性分析定性分析定性分析定性分析定性分析定性分析定性分析`利用保留值定性最基本的方法；基本依据是两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留值；但相反结论却不成立，即相同色谱条件下，具有相同保留值的两个物质不一定是同一个物质。尚需一些辅助技术`利用两谱联用定性；其他方法定性定性分析定性分析定性分析定性分析————保留值定性保留值定性保留值定性保留值定性1已知物保留值直接对照法定性`未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全相同，可初步确定为同一物质`改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍完全相同，则可认定为同一物质`优点：简单缺点：适用范围窄；必须有标准物质定性分析定性分析定性分析定性分析————保留值定性保留值定性保留值定性保留值定性min05020000400006000080000100000120000氨脒标准品未知化合物Agilent1100SeriesHPLC仪;AgilentZorbaxExtend-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相：乙腈－水－三乙胺(60：40：0.2，V/V/V）；紫外检测波长265nm；流速0.7mL·min-1；进样量10μL;柱温：室温例：2利用文献保留值数据进行比对定性`文献报道的保留值数据只能作为定性参考`液相色谱柱填柱技术复杂，重现性差；条件不允许，难以得到相同色谱条件（仪器、色谱柱、试剂等）`可根据文献数据和对照品选用已知标准物，再用已知标准物进行定性定性分析定性分析定性分析定性分析————保留值定性保留值定性保留值定性保留值定性定性分析定性分析定性分析定性分析————保留值定性保留值定性保留值定性保留值定性3利用已知物增加峰高法定性将已知标准物质加到待测样品，若某一峰增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物为同一物质4用三维图谱检测器定性`如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两峰的立体构形`二极管阵列检测器可同时比较保留时间和紫外光谱图。如果两项均一样，则可基本上确定为同一物质；如果保留时间一样，而紫外图谱有较大差别，则判定两者不是同一物质定性分析定性分析定性分析定性分析————保留值定性保留值定性保留值定性保留值定性AU0.000.050.100.150.20Minutes5.0010.0015.0020.0025.00x-21.894AU0.000.050.100.15Minutes5.0010.0015.0020.0025.00dpf-21.9020.000.050.100.150.20AU10.0020.00Minutes300.000.000.050.100.150.200.25AU10.0020.00Minutes300.00丹皮酚标准品六味地黄丸例：定性分析定性分析定性分析定性分析————两谱联用定性`如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同的保留值，则保留值定性准确度存在疑问`红外光谱、紫外光谱、核磁共振波谱和质谱对有机化合物有很强的定性能力，可用于定性`HPLC-紫外光谱已作为液相色谱的常规检测器使用；HPLC-MS和HPLC-NMR也十分成熟1色谱-质谱联用（HPLC-MS）`质谱属于液相色谱的广适性检测器`普通高效液相系统只能对已知化合物（有标准品的化合物）通过峰位保留值定性，对未知化合物无能为力`高效液相色谱—质谱联用可对未知化合物做多级质谱分析，通过多级质谱碎片推测未知化合物结构，进而准确定性定性分析定性分析定性分析定性分析————两谱联用定性`1983年开发串联质谱技术问世，发展十分迅速，已被作为成熟技术，广泛用于许多领域，特别是药学领域，并发挥了巨大作用`中药及植物药化学成分的快速筛选；中药品种、道地药材的鉴别；中药质量标准研究；药代动力学和药物代谢产物研究；非法掺假；刑事侦察；兴奋剂筛查；环境保护定性分析定性分析定性分析定性分析————两谱联用定性7x100.511.52+TICScanscan-blank.dCountsvs.AcquisitionTime(min)1234567891011127x10123+TICScanscan-volunteer2.dCountsvs.AcquisitionTime(min)123456789101112志愿者口服三苯双脒肠溶片后尿样一级全扫描色谱图空白药后定性分析定性分析定性分析定性分析————两谱联用定性两谱联用定性两谱联用定性两谱联用定性6x1000.51+Scan(8.481-9.439min,112scans)scan-volunteer2.d220.1178.1Countsvs.Mass-to-Charge(m/z)50100150200250300350400450500疑似代谢物峰提取质谱图4x10012+ProductIon:2(2.477-3.282min,24scans)(220.0-**)pro-volunteer2.d175.1134.2220.2Countsvs.Mass-to-Charge(m/z)100125150175200225250275300325350375400425450475500疑似代谢物子离子扫描质谱图由分子量及其质谱图可以确定该代谢物为乙酰化氨脒定性分析定性分析定性分析定性分析————两谱联用定性两谱联用定性两谱联用定性两谱联用定性2色谱-核磁共振联用（HPLC-NMR）`NMR是迄今为止功能强大的结构研究手段，可彻底解决多数有机物的化学结构问题，且对所有含检测核的化合物均有响应，具有极大的通用性`与HPLC联用要求有良好的色谱分离，但对色谱条件要求不高，普通色谱柱即可`适于药物杂质鉴定、药物体内外代谢产物的结构鉴定、天然产物化学筛选等定性分析定性分析定性分析定性分析————两谱联用定性两谱联用定性两谱联用定性两谱联用定性定性分析定性分析定性分析定性分析————其他方法1收集洗脱物后进行定性分析`收集色谱分离后的每一个分离组分`对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定定性分析定性分析定性分析定性分析————其他方法收集组分时应注意`某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化学检测器不可；`如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后的一小部分组分进入检测器`尽量考虑前后组分的影响，特别是分离不完全的组分`只收集峰顶附近组分，以消除定性时相邻组分的干扰`注意流动相中溶剂杂质的影响`注意色谱分离后组分被检测和被收集间的时差2化学衍生法定性`利用样品中某些化合物与特征试剂柱前或柱后存在的化学反应生成相应衍生物进行定性`适于官能团定性定性分析定性分析定性分析定性分析————其他方法其他方法其他方法其他方法定量分析定量分析定量分析定量分析定量分析定量分析定量分析定量分析`常用定量分析方法归一化法标准曲线法内标法标准加入法按测量参数分为按测量参数分为按测量参数分为按测量参数分为峰面积法和峰高法定量分析定量分析定量分析定量分析`色谱定量分析，峰高法或峰面积法的选择主要取决于检测器线性范围内，峰高和峰面积的准确性和重复性`归一化法最好选择峰面积法`标准曲线、内标和标准加入三种定量方法可选择峰高法和峰面积法定量分析定量分析定量分析定量分析--------归一化法`所有出峰组分之和按100%计算的定量方法，称为归一化法。`前提条件是样品中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都能产生信号。`组分i的质量分数可按下式计算：式中Ai为组分i的峰面积，f’i为i组分的质量校正因子。当fi为摩尔校正因子或体积校正因子时，所得结果分别为i组分的摩尔百分含量或体积百分数特点：1各组分须全部流出，并在检测器产生信号2与进样量无关3不需标样4简单定量分析定量分析定量分析定量分析--------归一化法`标准曲线法/外标法01234增加溶质的浓度工作标样储存标样定量分析定量分析定量分析定量分析--------标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法`实际色谱图0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes0.000.050.100.150.200.250.300.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes标准曲线05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值(峰面积)定量分析定量分析定量分析定量分析--------标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法`计算公式`特点需要标样标样及样品测定的条件须一致进样体积须准确iXiiiXARFCXRXCRFii样品响应值未知组分浓度∶标样响应值标样浓度校正因子∶×==)()()()(定量分析定量分析定量分析定量分析--------标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法定量分析定量分析定量分析定量分析----内标法内标法内标法内标法`配制一系列浓度的标样，其中加有内标01234增加溶质的浓度工作标样储存标样+储存内标样内标样浓度不变0.05.010.0min0102030mV0.05.010.0min0102030mV0.05.010.0min0102030mVXISXISXIS`实际色谱图标准曲线05010015020025001020304050样品浓度标样峰面积内标样峰面积定量分析定量分析定量分析定量分析----内标法内标法内标法内标法`计算公式：`特点：需要标样，需要内标结果与进样体积无关..)()()()().(siiXiiiXAARFCXCXRSIRRFii内标峰面积样品峰面积未知组分的浓度∶标样浓度标样响应值内标响应值校正因子∶×=×=定量分析定量分析定量分析定量分析----内标法内标法内标法内标法`对内标的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)不存在于待测样品中不与样品组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当与其他组分分离良好理化性质与待测组分相似，有相似分离萃取性质定量分析定量分析定量分析定量分析----内标法内标法内标法内标法定量分析定量分析定量分析定量分析----标准加入法`也称叠加对比法，实际上是一种特殊的内标法`是在选择不到合适内标时，以待测组分的纯物质为内标，加入到待测样品中`然后在相同色谱条件下，根据待测组分加入纯物质前后所测待测组分的峰面积，计算含量`优点：不需另外的内标不需精确进样操作简单`缺点：须保证加入待测组分前后色谱条件完全一致定量分析定量分析定量分析定量分析----标准加入法标准加入法标准加入法标准加入法谢谢！