高效液相色谱法(HPLC)―郭兴杰(沈药研究生课程)

高效液相色谱法（HPLC）highperformanceliquidchromatography沈阳药科大学药学院郭兴杰第一节：概述一、高效液相色谱法及其特点1.高效液相色谱法（HPLC）：以经典液相色谱法为基础,引入气相色谱的理论和实验技术，发展而成的分离分析方法。2.高效液相色谱法与经典液相色谱法、气相色谱法的区别（1）与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法分离过程经典液相色谱固定相：粒度：60~600μｍ（多孔）柱长：10~200cm（d=10~50mm）n约为2~50/m流动相：靠重力输送经典液相色谱无在线检测器差别：主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次是检测手段和输液设备。缺点：①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大。②无检测设备，分析速度慢、效率低。只能作为分离手段高效液相色谱法固定相：5~20μｍ，球形。流动相：高压泵输送液检测器：在线检测(2)高效液相色谱与气相色谱比较气相色谱法分离过程HPLC与GC的差别：主要在于做为流动相的液体和气体性质之间的差别，其次是操作条件和分析对象的差别。流动相惰性气体，与组分分子之间无作用力,只起运载组分的作用。各种液体，与组分分子之间有作用力，同时与固定相展开对组分的竞争，对分离起很大的作用。GC:HPLC:具有足够挥发性和热稳定性的物质、气体或沸点较低的化合物。分析对象广泛，只要求样品制成溶液无需气化。GC:HPLC:分析对象操作条件：温度：GC：一定温度下进行分离。HPLC：通常室温下进行分离。检测器：GC:TCD、FID、ECD和NPDHPLC:UV、DAD、FD、RID3.高效液相色谱法的特点（1）分离效能高（2）选择性高（3）灵敏度高（4）分析速度快（5）应用范围广二、高效液相色谱法在药物分析中的应用色谱法具有分离分析两种功能，因此在药物分析中，HPLC已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检查、杂质分离及含量测定的主要手段。中国药典：1953~2010年共出版发行八版滴定分析：各版均占50%以上。UV：用于含量测定、含量均匀度或溶出度测定。IR:用于原料药鉴别（2000版444个品种）85版开始收载HPLC法-7项90版-76项；2000版200多项；2010版-1000多项美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200年。出版发行了25版药典。75年（19版）将HPLC载入药典20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项；24版-含量测定法：1386项鉴别：519项杂质检查：206项如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为反映各国药典先进性的重要指标之一。问题：翻阅一下中国药典，总结一下HPLC在那些方面有应用？三、高效液相色谱法的分类1.按固定相的聚集状态分类液-固色谱；液-液色谱2.按溶质在两相间分离过程中的物理化学原理分类（1）吸附色谱（AdsorptionChromatography）（2）分配色谱（PartitionChromatography）（3）离子色谱（IonChromatography）（4）空间排阻色谱（SizeExclusionChromatography）（5）亲和色谱（AffinityChromatography）（6）手性色谱（ChiralStationaryChromatography）3.按流动相压强分类（1）高效液相色谱法（HPLC）（2）超高效液相色谱法（UPLC）四、高效液相色谱法的应用范围和局限性1.应用范围高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品及环境污染物。约占全部有机物的80%。2.方法的局限性（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境（2）缺少通用检测器（3）不能完全替代气相色谱（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，不是尽善尽美的。第二节高效液相色谱法的基本理论一、高效液相色谱参数1.定性参数tR、t0、t’Rt’R=tR-t02.柱效参数σ、W1/2、WW=4σ或w=1.699W1/2n=（tR/σ）2H=L/nn=（tR/w1/2）2×5.54n=16（tR/w）2Heff=L/neff3.相平衡参数K=CS/Cmk=ms/mm=CSVS/CmVm=K·VS/Vmk=tR/t04.分离参数R=2（tR2-tR1)/(w1+w2)R=1.0裸露面积≥95.4%R=1.5裸露面积≥99.7%R≥1.5完全分开（一）塔板理论将色谱分离过程比作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。二、高效液相色谱法的基本理论1.塔板理论的假设(1)每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。22/1R)(54.5WtnL为色谱柱长，H为板高，n为理论板数，三者的关系为：理论板数与保留时间和半峰宽之间的关系：HLn/2.由塔板理论推导出公式3.塔板理论仅为具有一定局限性的半经验理论缺点：（1）不能解释u不同（同一溶质），H（n）不同。（2）不能说明色谱柱结构参数、操作条件与塔板数的关系。（3）忽略了组分在色谱柱内的扩散和传质，因此不能解释影响塔板高度的各种因素。塔板理论对色谱体系的设计和色谱条件的选择的指导意义有限。（二）速率理论——VanDeemter方程（柱内效应）速率理论主要阐述使色谱峰展宽，柱效降低的各种动力学因素GC速率方程——VanDeemteer方程式H=A+B/u+Cu涡流扩散项纵向扩散项传质扩散项HPLC中的速率理论1.涡流扩散项A=2λdp•球形、小粒度、均匀固定相，匀浆高压填充，降低A2.纵向扩散项B=2γDm•Dm很小，且uu最佳，忽略B/uH=A+Cu3.传质阻抗项(1)固定相传质阻抗系数CS忽略，因df小(2)流动相传质阻抗系数C=Cm+Csm动态流动相传质阻抗静态流动相传质阻抗*动态流动相传质阻抗-在流路中心组分走的快*静态流动相传质阻抗-部分组分分子在固定相微孔内滞留C∝dp2/DmDm∝T/要求:固定相dp流动相都小流动相传质阻抗系数H=A+Cmu+CsmuHPLC如何提高柱效：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低黏度流动相，流速不宜过快；③柱温适当HPLC中的速率理论小结：（三）柱外效应柱外效应指由色谱柱以外的引起的色谱峰扩张的因素。柱外因素常指从进样口道检测池之间，除色谱柱以外的所有死空间，如进样器（I）、连接管（C）、检测器（D）等的死体积，都能导致色谱峰展宽、柱效下降。柱外效应存在的标志（1）k小的组分（k3）峰形产生脱尾或峰宽增加。（2）非保留峰的理论塔板高度大于保留峰第三节分离度及影响因素衡量色谱分离条件优劣的综合指标——分离度R色谱峰重叠情况第三节分离度及影响因素R=1.5的两个相邻色谱峰可以达到基线分离。不同分离度比较柱效低选择性可以柱效高选择性差柱效高选择性高二、HPLC法中影响分离度的因素分离方程式：柱效项柱选择项柱容量项理论塔板数n选择性系数容量因子k22114kknR=分别改变k,n或α时，对样品R的影响由图：k改变，峰位改变；n改变，峰宽窄改变；α改变，峰间距改变分离度不好：（a）容量因子k较小，应在适当范围增加容量因子（1k10）。（b）k合适，但分离度仍较差，应提高柱效。（c）两组分分配系数比α几乎为1，只能改变α。1.容量因子（k）对分离度的影响HPLC法中，k≈1~10，分析时间恰好合适改变k：HPLC法：主要通过改变流动相的极性（极性强度）GC法：主要通过改变柱温。2.理论塔板数（n）对分离度（R）的影响（1）固定相粒度小、粒径范围窄、球形的载体，减少涡流扩散和流动相传质阻力，尽可能采用大孔径和浅孔道的表面多孔或全多孔型载体，减少流动相传质阻力。（2）流动相选用粘度小的溶剂。适当增加温度。（3）提高装柱技术（4）适当增加柱长（分析柱10~30cm）3.α对分离度（R）的影响α是色谱柱选择性的量度，α越大，选择性越好。α1.01.0011.011.11.52.0（α-1）/α00.0010.010.0910.330.50选择性与两个组分在流动相和固定相相互作用，在这一点HPLC比GC有一个明显的特点。GC法中，组分分离只是利用固定相来提供不同热力学分配（固定相改变），而HPLC法中，可通过改变流动相来改变选择性，使流动相在热力学分配中起主要作用。（1）改变流动相组成（2）改变流动相PH值。此方法仅限于样品能离解的酸或碱。（3）改变固定相。如何改善HPLC的分离度（小结）通过下述方法降低色谱峰展宽增大分离选择性方法使用均一的载体●改变流动相的比例仔细填充柱子●改变流动相组成选择粒度小的载体●改变流动相pH减小进样量●改变固定相●降低系统死体积通过下述方法增加保留时间●选择合适的分离参数●增加色谱柱长度●增加固定相浓度●降低柱温和流速高效液相色谱法（HPLC）highperformanceliquidchromatography沈阳药科大学药学院高效液相色谱仪简介一、高效液相色谱仪的组成部分贮藏罐与流动相脱气高压泵和梯度洗脱系统进样装置色谱柱与柱温箱检测器色谱数据处理系统贮液罐与流动相脱气1.贮液罐耐腐蚀性0.5~21高于泵体密闭溶剂经0.45μm滤膜除机械杂质输出流动相管路插入一端连接在孔径过滤器的贮液瓶中2.流动相脱气处理：超声脱气、在线真空脱气除去其中溶解的气体防止产生气泡对基线噪音和灵敏度造成的影响防止某些组分氧化变性对色谱柱分离性能的影响•流动相：甲醇（色谱纯）,乙腈（色谱纯),水(二次蒸馏水）,醋酸•流动相预处理：溶剂使用之前过滤（0.45m滤膜，分为水膜和有机膜）一般用量筒量取。•流动相混合：可以事先混合，也可以有仪器来混合。•超声：除气泡。•进样：一般使用20l定量环。但可以多进样（大于或等于50l）。如果灵敏度不够，可以考虑用大的定量环，但峰会扩张（变宽）。•进样器：平头的。买好的很重要。•预柱：保护色谱柱。尤其是中药和生物样品，必须使用。可以反冲。•色谱柱：按照流动相流动方向安装。安装后检查是否漏，用滤纸（观察柱压）。要观察废液缸流出的流动相体积。•检测器：按照需要选择。•记录系统：按照需要选择。高压输液泵及梯度洗脱装置高压输液泵要求：1.泵体耐腐蚀2.能在高压下连续工作3.输出流量范围宽4.输出流量稳定，重复性好类型：1.恒流泵：输出恒定体积流量流动相注射泵（螺旋泵）柱塞式往复泵2.恒压泵（气动放大泵）：输出压力恒定，系统阻力不变时流量恒定；系统阻力改变时流量不恒定。柱塞式往复泵工作原理•柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱•向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体•前后往复运动，流动相源源不断输送到色谱柱中梯度洗脱装置梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相组成，以调节流动相极性，使每个流出组分都有合适的容量因子，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。梯度洗脱技术的优点是:可提高柱效、缩短分析时间，也可改善检测器的灵敏度。当样品第一个组分的k和最后一个峰的k相差几十倍至百倍时，采用梯度洗脱效果最好。此技术与气相色谱法中的程序升温相似。梯度洗脱方式有两种：低压洗脱和高压洗脱低压梯度洗脱系统：常压下将溶剂按程序混合，用一台高压泵送入色谱柱高压梯度洗脱系统：两台高压泵将溶剂增压后送入梯度混合室混合，再送入色谱柱进样装置1.六通阀进样2.自动进样器自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按标准编制注射样品的操作程序工作。取样、进样、样品管路清洗和样品盘的转动均按预定程序自动进行，一次可进行上百个样品分析。色谱柱一、柱材料及规格1.柱材料：内壁抛光的不锈钢管2.柱规格：直型。内径4.6mm或3.9mm；长度10~50cmODS柱（200mm×4.6mm，5μm）二、柱温控制用柱