核酶的作用方式与研究技术进展

核酶的作用方式与研究技术进展2012-10-24主要内容•核酶的定义及概述•核酶产生的背景•核酶的种类•核酶的催化机制•核酶的研究方法•核酶的应用前景和挑战•参考文献核酶的定义及概述•核酶(ribozyme)最初被定义为一类具有催化活性的RNA，即化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子，有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多，有的能够切割RNA，有的能够切割DNA，有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。总之，核酶的化学本质与由蛋白质构成的酶完全是不同的。但是，核酶与酶具有很相似的催化特性，并且与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。•随着生物学的发展，核酶不仅仅只是包括RNA，如今人们还人工合成了一些DNA也具有催化活性。所以现在的核酶应该包括催化性DNA和催化性RNA两大类，即：具有催化功能的RNA称为酶性RNA，又称核酶(ribozyme，Rz)；具有催化功能的DNA称为酶性DNA，又称脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)，两者统称核酶(nucleozyme)。核酶产生的背景核酶的发现，不仅颠覆了酶的本质是蛋白质这一概念，还引出了“RNA世界”的假说。该假说认为RNA在生命进化的早期阶段具有非常重要的作用。20世纪80年代初，由美国科罗拉多大学托马斯·切赫（ThomasCech）等在研究四膜虫rRNA前体中发现了与蛋白质无关的拼接过程，即在鸟苷和Mg2+存在下发生的自我催化作用，可将rRNA前体中存在的链长414个核苷酸的内含子切下。这一段切下来的L19RNA具有很强的酶活性，它既能使核苷酸聚合成多核苷酸，又能将多核苷酸切成不同长度的片断，因此将这一L19RNA片断称为酶性RNA，又称核酶(ribozyme)，它集信息和催化功能于一身，由此提出了核酶的概念；–时隔不久，耶鲁大学的Altman在大肠杆菌中发现了RNaseP，该加工酶RNaseP(由蛋白质和RNA组成的复合物，催化切除tRNA前体的5‘端冗长序列，故也叫tRNA5’-成熟酶)中的RNA(绝对不含蛋白质)，在特定条件下，具有与RNaseP全酶相同的催化活性，即单独RNaseP-RNA能使tRNA的5‘端成熟；Cech和Altman于1989年共同获得了诺贝尔化学奖；1995年~1996年澳大利亚Symons实验室在研究拟病毒等的复制机制时发现，通过滚环复制生成复制单体是自动进行的，因为它们具有能催化自我剪切（self-cleavage）的“锤头结构”；2000年研究证明核糖体也是核酶，具有肽基转移酶的功能。核酶的种类•具有催化功能的RNA称为酶性RNA，又称核酶(ribozyme，Rz)；•具有催化功能的DNA称为酶性DNA，又称脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)。1.核酶(ribozyme，Rz)Rz广泛存在于由低等到高等的多种生物中，参与细胞内RNA及其前体的加工和成熟过程。目前人们已发现了七大类自然存在的核酶，即第一类内含子（group1intron）、第二类内含子（group2intron)、RNaseP亚基（RNAsubunitofRNaseP）、锤头型核酶（hammerheadribozyme）、发夹型核酶（hairpinribozyme）、肝炎ƍ病毒（hepatitisdeltavirus,HDV）核酶、和VS核酶（Neurosporavarkudsatelliteribozyme）。•根据分子大小，可将它们分成大分子核酶（包括第一类内含子、第二类内含子和RNaseP的RNA亚基）和小分子核酶（锤头型核酶、发夹型核酶、肝炎ƍ病毒和VS核酶）。自然界中的Rz多在分子内起作用(除RNaseP和核糖体外)，即Rz的活性区域与作用底物序列在同一条链上，其底物主要是带有磷酸二酯键的核酸（非核酸底物的Rz自然界是否存在仍无定论）。1.1大分子核酶大分子核酶又分为第1类内含子、第2类内含子和核糖核酸酶P（RNaseP）的RNA亚基等3种，它们都是由几百个核苷酸组成的结构复杂的大分子。大分子核酶可以看成是金属酶，其催化作用与金属离子尤其是二价离子密不可分，这些金属离子或者作为广义酸碱，或者作为路易斯酸碱催化内含子的剪接。第一类内含子存在于各类生物的细胞器基因和核基因中，甚至在噬菌体中也有发现。其代表分子有：四膜虫mRNA前体，藻类线粒体mRNA和tRNA前体，玉米及豆类叶绿体rRNA前体，T4噬菌体胸腺嘧啶合成酶转录产物。其中纤毛原生动物四膜虫（trahymena）的大rRNA前体的剪接机制很早就已经相当清楚，从而成为第一类内含子剪接机制的模型。固氮弧菌属中第一类内含子的共同组装过程第二类内含子第二类内含子的代表分子是酵母线粒体细胞色素氧化酶mRNA前体，真核snRNA前体。这两类内含子的区别在于第一类内含子有一个由10-12个碱基的保守序列构成的“中心核心结构”（centralcorestructure），而第二类没有。RNasePRNaseP是一种由RNA和蛋白质构成的复合体，其中的RNA是真正的活性中心，蛋白质部分只是起支持结构的功能。RNaseP是一种核酸内切酶，它参与加工tRNA的初始转录产物，所有的tRNA5’末端都由该酶催化产生。1.2小分子核酶小分子核酶比较常见的有4种，锤头型、发夹型、HDV、VS核酶。目前，锤头型和发夹型核酶是研究最多的。小分子核酶有一些共同的特征，首先与前面提及的大分子核酶相比较小，其次它们都天然的与其发生作用的RNA的复制过程有关，最后在各种情况下经由它们产生的催化作用都将产生5-羟基末端和2，3-环状磷酸基末端。另外其催化机理与其分子结构密切相关，金属离子或特定碱基都可作为催化反应的关键成分。锤头状核酶活性中心由11个保守的核苷酸和数目不等的非保守核苷酸序列组成，即：5’GAAA(N)nNUH(N)n，CUGA(N)nGA3’，它能结合含有NUH序列的底物RNA，其中N代表A、C、G，但更偏好G；H代表C、U、A，但更偏好C。在其活性中心两端含有与底物RNA结合位点NUH两侧互补的序列(FigA)。(A)Hammerheadribozyme发夹状核酶发夹状核酶(hairpinribozyme)是一种具有自剪切催化功能的小分子核糖核酸，是人们首次在烟草环斑病毒卫星RNA(TobaccoringspotvirussatelliteRNA，sTRSV)的负链上发现的，因其活性中心的二级结构形似发夹而得名。与其它类型的核酶相比，发夹状核酶具有对金属离子和酸碱度变化依赖小等特点，因此有很高的应用价值。发夹状核酶有多个螺旋区域，同样与底物形成2个螺旋区(FigB)．(B)Hairpinribozyme2.脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)脱氧核酶DRz是利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段。DRz的活性部位能在原子水平上区分底物，并催化类似反应。所有的DRz都是单链分子，如同单链RNA分子一样，能进行折叠、催化和展现酶活性。通过实验创造的DRZ连续被发现并且催化性能不断提高。自1994年首次发现脱氧核酶以来，迄今已发现的DRz有几十种。根据其功能可分为7大类：1．具有RNA切割活性；2．具有DNA连接酶活性；3．具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性；4．具有DNA水解活性；5．具有DNA激酶活性；6．具有N2糖基化酶活性；7．具有DNA戴帽活性。但有类似催化活性的DRz在自然界中还没找到。在所有的DRz中，最特别的是具有RNA切割活性的DRZ，它能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平对基因灭活，从而调控蛋白质的表达，可能成为对抗病毒感染、肿瘤等疾病的新型基因治疗药物和基因功能研究、核酸突变分析等的新型核酸工具酶。目前发现多种此类DRz，最主要的2种是Santoro等从1014个随机序列中通过体外PCR筛选法获得的第10轮循环的第23个和第8轮循环的第17个克隆，分别命名为“10-23DRz”和“8-17DRz”，其中对10-23DRz家族的研究最深入。10-23型脱氧核酶的结构8-17型脱氧核酶的结构核酶的催化机制•大型核酶的催化机制•小型核酶的催化机制大型核酶的催化机制第一类内含子与第二类内含子通过一种两步反应来切割初始转录物，进而将外显子连接起来，产生成熟的RNA。RNaseP是产生tRNA5’端的核酶，所有的tRNA5’端都由它产生。它们的催化反应发生时都伴随有磷酸基团的变构。第一类内含子的催化机制第一类内含子的催化过程如下：第一步，鸟嘌呤单核苷酸的3’-OH进攻切割位点的5’磷酸，产生游离的5’外显子。这一步只能由鸟嘌呤核苷酸来催化，但可以是单核苷酸，也可以是二核苷酸或三核苷酸，这表明此反应不需能量的介入；第二步，游离的5’外显子的3’-OH进攻3’切割位点的磷酸，两个外显子连接起来同时游离出带有外来鸟嘌呤的内含子。这两步都是可逆的。内部引导序列（IGS）可以与底物部分配对，进而来定位切割位点。切割下来的内含子又进一步自身环化，去除一小段核苷酸，产生内含子核心L-19。第一类内含子的自剪接反应第二类内含子的催化机制第二类内含子的催化过程如下：第一步，内含子里面（与第一类内含子不同）一个保守的腺嘌呤残基的2’-OH进攻5’磷酸，产生5’游离外显子和由3’外显子与内含子构成的中间体；第二步，5’游离外显子的3’游离羟基进攻3’切割位点的磷酸，两个外显子连接起来，并切割下内含子。RNaseP的催化机制RNaseP催化所有tRNA的5’末端的形成，但是由于tRNA的5’末端没有保守序列，人们认为RNaseP是通过识别底物的三级结构来完成的。其催化反应需要二价阳离子（如Mg2+或Mn2+）和一价阳离子（如k+或NH4+）的共同参与。其中一价离子在反应中主要用来稳定结构，而二价离子不仅对于稳定结构，而且对于切割是必需的。在切割反应中，金属离子活化的氢氧根被用作亲核试剂。小型核酶的催化机制锤头型核酶的催化机理锤头型核酶对切割位点的识别遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A，U或C）。它的催化过程需要二价金属离子（如镁离子）的参与，人们提出两种催化机理：单金属离子催化和双金属离子催化。图5锤头型核酶两种可能的催化机理（a）单金属离子催化；（b）双金属离子催化。单金属离子催化机理如图a，在这个模型中，金属氢氧化物作为广义碱从2’OH接受质子。活化的2’氧作为亲核试剂进攻切割位点的磷酸。双金属离子机理如图b。A位点的金属离子作为路易斯酸（Lewisacid）接受2’氧的电子，使2’OH去质子更容易。B位点的金属离子也作为路易斯酸接受5’氧的电子，使O-P键极化且键合力减弱，从而使氧原子更容易游离出来。HDV核酶的催化机理现在被普遍接受的催化机理如图所示。在基态时金属离子结合于切割位点处未成桥的氧原子上，但是在自切割过程中金属离子脱离了与氧原子的直接联系，转而通过一种远距离的作用力与之作用。另外，底物的5’端序列对切割反应有一定影响。HDV核酶可能的催化机理发夹状核酶的催化机理顺式切割发夹型核酶的底物部分与核酶的其余部分是分离的，底物切割位点必须含有RYN*GUC这样一个序列，R代表嘌呤核苷酸，Y代表嘧啶核苷酸，N可以是任何核苷酸。催化发生时，发夹型核酶通过反式转酯反应于图（b）的箭头处切割底物，产生5’-OH和2’，3’-环磷酸末端。核酶的研究方法为了寻找新的和更高效的Rz和DRz，参照RNA分子进化技术提出了Rz和DRz的离体筛选方法。目前，一般认为Rz和DRz的筛选途径有2种，一种是利用天然的RNA或DNA分子在体外筛选出具酶活性的RNA或DNA分子，另一种是通过人工合成并在体外筛选出具酶活性的小片段的RNA或DNA分子。但是第一种途径，在筛选的过程中具有一定的不准确性，通常不被采用，而第二种途径的筛选过程无以上缺点，是一种被普遍采用的筛选途径。自上世纪90年代初初步建立核酶体外筛选法（通常称作SELEX法）以来，至今已利用这一方法制造出无数自然界尚未发现的核酶，以