循环血microRNA检测对胰腺疾病诊断价值的初步探讨

第二军医大学博士学位论文循环血microRNA检测对胰腺疾病诊断价值的初步探讨姓名：孔祥毓申请学位级别：博士专业：内科学（消化系病）指导教师：李兆申2011-05循环血microRNA检测对胰腺疾病诊断价值的初步探讨-1-摘要microRNA是小的RNA分子，平均22个核苷酸的长度。目前除了真菌和海洋植物外，microRNA几乎可以在所有的生物体内检测到。microRNA属于非编码性的RNA，其通过调节转录后的蛋白质翻译过程（互补结合到目的信使RNA的特定区域），起到抑制蛋白质表达和基因沉默的作用。目前，科学家在人类基因组中已经发现了超过1000种microRNA，特异性或非特异性的富集于不同的细胞中。据推断：超过60%的蛋白表达基因都受到microRNA的调节。在植物和多细胞动物中，microRNA的结构和作用方式存在着很大的差异。首先，microRNA与靶序列结合的吻合度在两者间是不同的：植物中，microRNA几乎与其靶序列完全匹配，microRNA与mRNA间的作用往往是一对一的。而在多细胞动物中，microRNA往往只通过种子区域与mRNA的特定序列相结合，起到抑制蛋白质表达的作用。另一方面，microRNA在两者mRNA中靶序列的位置存在很大的差异：在多细胞动物中，microRNA的作用区域往往是3’端的非转录区，而在植物中，其作用区域更多的位于mRNA的蛋白质编码区域。microRNA在真核生物中非常保守，提示其可能在生物进化中起到非常重要的基因表达调控作用。尽管1993年就开始出现microRNA的相关研究，但直到2000年后，人们才意识到microRNA在生命活动中的重要意义。目前的研究表明：microRNA几乎参与了生物的所有病理生理过程（发育、增殖、凋亡、癌变等）。胰腺癌是一种预后很差的恶性肿瘤。近年来，其发病率逐年上升。每年世界范围内超过200000人死于胰腺癌。其中，发达国家的发病率和死亡率昀高。在美国，胰腺癌在所有肿瘤死因中居第四位，每年新诊断的胰腺癌超过28000例。在日本，其在肿瘤死因中居第五位，每年有超过20000个新发病例。在发展中国家，胰腺癌的发病率也有逐年升高的趋势。由于胰腺癌的致死性很强，因此其发病率基本上与死亡率一致。外科手术是治愈该疾病的唯一有效手段，接受完全胰腺癌手术切除的患者，五年生存率可达20%至30%。但胰腺癌诊断时往往已近晚期，许多患者因此失去了手术机会，胰腺癌的早期诊断始终是肿瘤研究领域的热点。2008年，科学家发现microRNA可以在血清中稳定的存在，且其在循环血中的表达谱随着机体生理病理情况的改变而发生变化。更重要的是，与既往标志物相比，其出现的更早，检测的阈值更低，提示其在肿瘤的早期诊断中具有非常重要的价值。一、血浆microRNA检测在胰腺癌的诊断和预后判断中的价值研究背景：2008年，人们发现microRNA可以在循环血中稳定存在，且在不同的生理第二军医大学博士学位论文-2-病理情况下，循环血microRNA的表达谱会发生改变。胰腺癌是预后很差的恶性肿瘤，手术治疗是唯一可以将其治愈的有效手段，研究胰腺癌患者循环血microRNA表达谱的变化，对于患者的诊断、预后判断及治疗方案的选择，具有非常重要的意义。目的：寻找特定的异常表达microRNA，作为微创性的诊断手段，探究其对胰腺癌早期诊断及预后判断的价值。方法：长海医院2007至2009年间的35名胰腺导管腺癌患者纳入此项研究。抽取15名确诊为慢性胰腺炎，及15名健康志愿者的血清作为对照。抽取血清中的microRNA，采用实时定量PCR的方法，对特定的成熟microRNA进行定量，经过统计学分析，研究三组间microRNA表达量的变化。结果：本研究采用7个既往文献中报导胰腺癌组织中高表达的microRNA（microRNA-21,155,221,222,196a，181a，181b）作为筛查对象。其中三种microRNA（miR-21,155,196a）在不同的组别间含量差异显著。miR-21可以将胰腺癌患者同慢性胰腺炎患者（p=0.033）及正常成人（p=0.001）鉴别开来，而miR-155及miR-196a可以将患有胰腺疾病的患者（胰腺癌及慢性胰腺炎）同正常成人鉴别开来（p=0.0002和0.010）。能否手术是影响胰腺癌患者预后非常重要的因素，因此我们进一步将胰腺癌患者分为可手术组（I、II期）及非手术组（III、IV期），探究循环血microRNA量的变化与手术适应征的相关性。在7个所研究的microRNA中，血清miR-196a的含量在不可手术组患者中显著高于可手术组（p=0.001）。而且，血清中miR-196a的表达量具有潜在的预后判断价值。血清中miR-196a含量高的患者，平均生存期仅为6.1个月（95%可信区间：4.49至7.72个月），而含量低的患者平均生存期可达12个月（95%可信区间：5.52至18.08个月）（p=0.007）。结论：在胰腺癌，慢性胰腺炎及健康对照间，血清microRNA存在差异性的变化，提示其可以作为胰腺疾病诊断的标志物。血清miR-196a可能是一种胰腺癌预后判断及能否开腹手术的有效的标志物。二、循环血microRNA对于疾病诊断的机制探讨背景：自2008年循环血microRNA被发现至今，对血浆/血清microRNA表达谱变化的探索及其对疾病诊断意义的研究方兴未艾。尽管如此，对循环血中microRNA的来源，目前尚没有定论。一些研究发现：组织中特异性表达的microRNA可以在组织损伤的情况下，进入循环血，成为特定的标志物。由于肿瘤的发生发展过程类似于一种“永不愈合的创伤”，由此可以设想，肿瘤组织中高表达的microRNA可以进入循环血，作为肿瘤标志物。目的：以急性胰腺炎作为胰腺损伤模型，研究胰腺特异性microRNA在血浆中的循环血microRNA检测对胰腺疾病诊断价值的初步探讨-3-含量变化，为胰腺癌循环血microRNA作为标志物研究提供一定的理论基础。方法：在该部分研究中，我们采用了两种大鼠模型。将L-精氨酸诱导的大鼠急性胰腺炎作为一种模型，来探究血浆中miR-216a（特异性表达于胰腺组织）对于急性胰腺损伤的诊断价值；使用单孔穿破盲肠诱导的非致死性脓毒血症作为另一种模型，来探究血浆miR-216a与既往两种胰腺损伤标志物（淀粉酶及脂肪酶）相比在诊断急性胰腺损伤方面的优势。血浆样本在特定时间点收取。总RNA通过酚氯仿方法抽提。采用反转录实时定量PCR的方法对血浆中的miR-216a进行定量。结果：在急性胰腺炎模型中，先后在五个不同的时间点采集大鼠的血浆样本（L-精氨酸注射后0,12,24,48,72小时）。在这些时间点中，血浆miR-216a在24小时和48小时的含量显著升高（与0小时的时间点相比，P0.01,Krukal-Wallis检验）。在单孔穿破盲肠诱导的非致死性脓毒血症模型中，血浆淀粉酶和脂肪酶的含量，在术后24小时显著升高（与0小时相比，P0.01和0.05。PariwiseBonferroni校正t检验），而在该模型四个时间点收集的血浆中并未检测到miR-216a的变化。结论：我们的研究首先报道了血浆miR-216a对急性胰腺损伤的潜在诊断价值，且验证了其在某些条件下，特异性高于现有的临床常用标志物。为胰腺癌患者循环血中microRNA含量增高的来源研究提供了一定的理论依据。microRNA是一种小的（平均22个核苷酸长度），非编码蛋白质的RNA，其在多细胞动物中主要通过作用于信使RNA的3’非编码区，起到抑制蛋白质表达的作用。近年来，科学家们发现，生物体液中存在着稳定的microRNA，且其表达谱随着机体的生理病理变化而发生改变，提示其在疾病诊断中的重要价值。本研究探讨了7种microRNA对于胰腺癌诊断及预后研究的潜在价值。由于胰腺癌是“一种永不愈合的损伤”，因此，有理由猜想胰腺癌患者循环血中升高的microRNA来源于组织中高表达microRNA的释放。这一猜想在L-精氨酸诱导的急性胰腺炎模型中得到验证。血浆miR-216a在该模型中显著升高，且在脓毒血症模型中，其特异性高于现有的临床常用标志物（淀粉酶，脂肪酶）。关键词：microRNA，胰腺癌，急性胰腺炎，诊断，预后，生存期第二军医大学博士学位论文-4-AbstractMicroRNAisakindofsmallRNAmolecule,withitslengthaveraging22nucleotides.Toourknowledge,microRNAscanbedetectedinalmostallkindsofbiologies,exceptinfungiandmarineplants.MicroRNAisasortofnon-codingRNAs.ThroughcomplementarytargetingspecificregionsofmRNA,itposesitsinhibitoryeffectsonproteintranslation,resultinginspecificgenesilencing.Atpresent,morethan1000kindsofdifferentmicroRNAshavebeenfoundinhumangenome,whichspecificallyorunspecificallyenrichedindifferentkindsofcells,modifyingmorethan60%ofproteincodinggenes.Inplantsandmetazoans,microRNAsshowdistinctfunctionpatterns.Ononehand,thecomplementationofmicroRNAtoitstargetmRNAvariesbetweenthesetwospecies:inplants,microRNAisalmostperfectlycomplementarytoitstargetregionsinmRNAs;whileinmetazoans,thiscomplementationisfarfrombeingperfect,throughwhichonespecificmicroRNAcouldsuppressdifferentmRNAs’translations.Ontheotherhand,microRNAs’targetregioninmRNAbetweentwospeciesarequitedistinct:inmetazoans,microRNAusuallytargetsthe3’untranslatedregion;whileinplants,thetargetregionsusuallylocateintheproteincodingregions.microRNAisquiteconservedineukaryoticcells,indicatingthatitmayplayimportantrolesinbiologicalevolutionthroughsuppressingcertainproteins’expression.ThoughmicroRNAwasfirstlydiscoveredin1993,itisnotuntil2000sthatpeoplebegantorealizetheimportancethatitholdsinbiology.CurrentstudiesshowthatmicroRNAsarealmostinvolvedinallkindsofbiologicalandpathologicalprocesses(includingdevelopment,proliferation,apoptosis,andcarcinogenesis,etc.)Pancreaticcancerisakindofmalignanttumorwhic