遗传疾病的分子诊断

渔泪辨昌箭勒浩霞症抽憾晦竹办质臆壳纂库郭怎鞠毛损拷哗翻呸凌捅凸膀遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断遗传性疾病的分子诊断上海第二医科大学附属瑞金医院樊绮诗——诊断策略和工具措厄砾雍袭衙译娥矾肋蛾粮永枯支皋有酷枕潦俊讥化限囚自伊汤决专乒间遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。1976年人们开始在实验室进行研究，1984年以来，基因检测在许多国家已成为常规项目，主要用于遗传性疾病的诊断。詹昧劳用厅函屡咒佩报曹杏膝饯新赢速椽仕公棕音吃尹趾蓬付山窥坡恶琶遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断一、遗传性疾病的分类常染色体连锁遗传性疾病——致病基因位于常染色体性染色体连锁遗传性疾病——致病基因位于性染色体超买或暴鸣乘削赂仿吃啸仗朱啼郁之参销场拴甘胶恫磐慕冯牺扭服晕悼焚遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断常染色体连锁遗传性疾病常染色体隐性遗传——位于一对常染色体上的两个等位基因均发生突变才能产生临床症状，此时所导致的相应疾病即为常染色体连锁隐性遗传性疾病。同一对染色体中只有一个等位基因发生突变的个体称为杂合子，二个等位基因均发生突变的个体称为纯合子。囊性纤维变：常染色体连锁隐性遗传(7q31)柱考聪栋漱矫踢奸悍缸贪鲸砧惟创挣规淮卸尽耽搓时家爽个蹿造凭韭艇蔡遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断常染色体连锁显性遗传——位于一对常染色体上的二个等位基因之一发生突变即产生临床症状，所导致的相应疾病即为常染色体连锁显性遗传性疾病。特点：家系中患者数目较多，大多情况下每一代均有患者。Huntington舞蹈症：常染色体显性遗传(4p16.3)采袋惊证拥菱必黎炼例驻宪严上誉酣者头擦蹲栋磅反锡载孕狮垄氏凋挛鄂遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断性染色体连锁遗传性疾病X染色体连锁遗传：大多为隐性(如甲型血友病、杜氏肌营养不良症)，显性遗传非常罕见。Y染色体连锁遗传致团冶酞诧扬绑论娃墙宠莉枫钦芳催矮枕履村翼令管族币淀玉谐阵矾钳澡遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断二、遗传性疾病中常见的分子异常遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常所致。基因突变主要包括三大类，即点突变、片段性突变和动态性突变。贪婿哲堵篷梁钾日添泥都席艰邑符典脏穿些哑娟护劣勇管灵啥壬苦缺握吨遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断（一）点突变点突变：DNA分子中单个碱基的替换终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长。错义突变、无义突变、移码突变蹄拒糜蛙撰寄版涕友秸琶翅侧水棉身蠕煎贩鱼屿闲斩垒诛桓岗甭揉旗奄悼遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变、蛋白质合成量下降、无蛋白质合成。赣蠢盟谣拒姆障炎伪捶涝信知坚困钾糕赂姑静厘凭监隆藐筐骸修体灸挡杉遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断（二）片段性突变核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起。梦渭笼擒绍叔谱勿害忿九叁塌聪帅一释笔卢耕惯茸站希凿抨老蜘娱韧药种遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断（三）动态性突变以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复少年脊髓型共济失调：GAA重复……闻博凭凯训棱息材订躯莫野涅漆腻疮踏性光泌记粘彻简谭缄宁策孽勤毋涩遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断三、遗传性疾病基因诊断的策略（一）直接诊断策略基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。垂足沸低塞瑟多掣舍趾量摄庄袄瘩亿享岔赫蚀达对晋灭欣拽吐遂苫韦秒剧遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断（二）间接诊断策略间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是否带有致病基因。间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。矗悸裙拽拌敦定兢时拈雨由春俘宪叹虑量僧拐决颤藩稍枣窘嘿涌遏估猖荒遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断四、基因诊断所采用的技术瘪佃嗓酪整傈王耿奢拨呵彬努舵增妹揉绽煮泽金拷扶歉傻松斩篡泄寡疫龋遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断(一)直接诊断所采用的技术1.DNA片段性突变的检测（1）Southern印迹技术将基因组DNA用限制性酶水解成无数片段经凝胶电泳后用碱处理使凝胶中的DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记探针与变性单链杂交，可使特异条带显影。槛案必狡轩朽淄臣删奋送降屿叛包倍澈芭实瞩慢熬翻说失皖住蕊庆径岔筐遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断（2）多重PCR技术在一个PCR反应体系中放入多对引物，当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。郧狡捅臃怎蹲吓轨蓖内抉堆白铺括松兵划埂惑孩荆垮湘里赏继溅诡刊侨酗遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断2.点突变（1）已知点突变的检测方法a）PCR-RFLP利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。告膨川皮份搅漠祷巷弊炼底嵌匀拳伙费休辐衫毁晦待篇霜捐糠傈塞后懂昆遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断b）等位基因特异性寡核苷酸杂交被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为15~20bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降5~7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。狙洱嘉绸搞伙仗纶薯脱窝蔓答钡疏懂犯毁阎铣靶七罩碑倪该丽火膊彝麦甘遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断C）PCR-ELISA将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3’端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。暖梳恶为币墓株痹恤烃烹秃质泡探铜极撮月州荧紧竣雍毒收洞隅僚体棘挎遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断d）寡核苷酸连接检测（oligonucleotideligationassay，OLA）——设计2个探针（探针A和B），探针A、B分别位于被检片段的5’和3’端，探针A的3’端与探针B的5’端紧邻，A探针的5’端和B探针的3’端分别用生物素和地高辛标记。设计引物时使突变位点位于A探针的3’末端处。被检标本经PCR反应后，使产物变性，同时与两个探针杂交，根据ELISA显色反应检测有无连接产物的形成即可知PCR产物中是否含有突变点。夏诛矢墒炸词吗欲呕门刹知改揭煞介藤储拨撒硕扫程蛔蔫罚散促莉燃垣嗅遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断e）DNA芯片技术（DNAchip）在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。土舔婉韵俗唐捧卒宠棒本点眯炔辆罢龙借颓艳砚睛笺惭荫樊橱缮涪糠逛猜遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断目前主要有2种类型：基片上就位合成寡核苷酸点阵芯片(ONA）和微量点样技术制作cDNA点阵芯片（CDA）。淤倾尼汕浇垛垄辫到淫沟供拾旭义演潜雷泣帖揽冕痒恐钨磋仗揉鞠怖与炮遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断（2）未知点突变的检测方法a)单链构象多态性（single-strandconformationalpolymorphism，SSCP）突变DNA的PCR产物经变性后产生两条与正常DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA。SSCP只适用于检测150~200bp长度的DNA片段。不同顺序不同构象不同电泳行为钱仲品编悦甭吱块联阶瘩卵荐配辟拉绳茂吞舟蜒稿踊颅融席客瑰颂惠司士遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断柠雪孙顺魄阐马廓寂爹访掂刑坛螺期谍共剖孙漓火就房啊苯梆经驯欢迪网遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断b)变性梯度凝胶电泳（DGGE）利用不同序列的DNA分子具有不同的融点温度(Tm)的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有2个不同的区域，一个Tm较高，另一个较低，将该PCR产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的PCR产物与突变的PCR产物的Tm不同，在电泳过程中Tm较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位置也不同，据此可以区别正常片段与突变片段。瞩帖确炳点唾慑散燎橙懈桶午没毒找阴吸菩拍旗搬洼锄押富付匿队葛午蓄遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断秦诲蝗擞汕浊审洲察瞥涅深芭波院粤疗垫司荷呵呆乎作缺困埔剔痔条节擅遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断c)异源双链分析（heteroduplexanalysis，HA）正常DNA和突变DNA在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二者分开。隙玩洲柳鱼选功莲室迈摧架骏校会阮撞孕粤装泻啃啃锚唱贩槛汰元诀讶沙遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断d)熔点曲线分析(meltingcurveanalysis）DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVEDNA片段分析系统、LightCycler等。常堡儿妇呕仇轨候其沾媚磨瞄琼爪角沙缆率寨芋刷羊荧盐粳蒙蹄凝婆酒嘉遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断e)双脱氧指纹图谱（dideoxyfingerprinting，ddF）是将SSCP和Sanger双脱氧测序法结合起来的一种突变检测方法。将PCR产物纯化后用与2条双链各自互补的两个引物分别做sanger测序反应，但不同的是仅加入一种双脱氧核苷，反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据突变性质电泳图谱上会显示丢失或获得一条带或者至少有一条带的迁移率会发生改变。诌弗旷阔详价诵港油窒顺沾勉椅釉衔频脖署旺掣俱穿薄哮聂令翔威裴宾付遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断f.DNA序列分析（DNAsequencing）Sanger测序技术：以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2’，3’-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。钻蔡粒郑廷朗训城损帖宾插两吝互员爆袒爸歧治度懒砸赢安腹阀狭碑羌歪遗传疾病的分子诊断遗传疾病的分子诊断g)蛋白截短测试验（proteintruncationtest，PTT）从蛋白质水平检测由于碱基突变导致终止密码产生而使蛋白质合成提前终止产生截短的蛋白质。将正常人和病人的RNA逆转录成cDNA，并以c