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第一章基因工程第一节基因工程概述一．基因工程的概念操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因分子水平剪切→拼接→导入→表达人类需要的基因产物由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。二．基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。（二）“分子针线”——DNA连接酶1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。★DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA双链单链模板不要模板要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质(三)“分子运输车”——载体1.载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。三．基因工程的基本过程(一)获得目的基因（目的基因的获取）1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。②用人工的方法合成。★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数形式扩增(二)制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）1．重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。(三)转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。③将目的基因导入微生物细胞：Ca＋处理法。(四)筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。第二节基因工程的应用1．运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。2．基因工程的应用（1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。（2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。（3）基因诊断和基因治疗：基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。实例：ADA基因缺陷症的基因治疗第三节蛋白质工程1．蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。2．蛋白质工程的基本原理预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→具有预期功能的蛋白质3.蛋白质工程的应用（1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。（2）合成嵌合抗体。（3）改变蛋白质的活性。★蛋白质工程与基因工程区别蛋白质工程基因工程实质通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质将目的基因从供体转移到受体细胞，并在受体细胞中表达结果合成自然界不存在的蛋白质只能生产自然界已存在的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程第二章细胞工程第一节植物细胞工程【基础梳理】一、植物组织培养1、植物细胞的全能性（1）生物细胞的全能性生物体细胞一般都是受精卵经有丝分裂形成，因而都含有生物一整套遗传物质，都具有发育成完整个体的潜能。但在生物体上有时不能表现出其全能性，只能通过分化形成不同的组织、器官，这是在特定的环境、激素等的影响下基因选择性表达的结果。（2）植物细胞具有全能性的原因植物体的全部体细胞都是从受精卵经过有丝分裂产生的，具有发育成完整个体所必需的全套遗传物质。（3）细胞表现其全能性的条件离体、无菌、一定的营养条件、植物激素诱导、环境条件（脱分化避光，再分化需光）。（4）全能性的大小受精卵全能性最大；高度分化的植物细胞具有全能性；高度特化的动物体细胞的全能性受到限制，它的细胞核仍保持着全能性。全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞。2、植物组织培养（1）理论基础（原理）：细胞全能性（2）核心：脱分化形成愈伤组织和愈伤组织再分化。（3）过程：（4）培养基的成分水分、无机盐、碳源、维生素、生长调节剂（细胞分裂素和生长素）、有机添加物等。（5）进行植物组织培养时需要注意的问题①所以实验用具严格灭菌。②接种过程严格的无菌操作。③愈伤组织培养：最初避光培养，后期见光培养。④试管苗培养：先要进行生芽培养，再进行生根培养，试管苗培养要在光照条件下进行。3、植物组织培养的应用二、植物细胞培养（1）概念：在实验室工厂化生产的条件下，将组织培养过程中形成的愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行悬浮培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。（1）植物快速繁殖：优点是取材少，周期短，繁殖率高，便于自动化管理。（2）培育无病毒植株：所用材料是植物分生组织（根尖、茎尖）的生长点细胞。原因：分生区极少感染病毒，甚至无病毒（3）制造人工种子：①取材：胚状体②特殊加工：加入某些农药、微生物、除草剂③优点：育种周期短、便于贮藏和运输④缺点：抗菌性差、萌发率低。（2）与植物组织培养的关系①植物组织培养是植物细胞培养的基础。②目的不同：植物组织培养的目的是得到更多的植物体，植物细胞培养的目的是获得人类所需的细胞。（3）实例：成功地培养红豆杉的细胞，从中提取出重要的抗肿瘤药物——紫杉醇。三、植物体细胞杂交技术1、概念：是将不同种植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培养成新的植物体的技术。2、理论基础（原理）：植物细胞的全能性和细胞膜的流动性。3、过程4、注意（1）去除细胞壁的方法为酶解法：利用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁。（2）诱导融合的方法：①物理法包括离心、振动、电刺激等。②化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）原生质体融合后的细胞是杂种细胞，利用植物组织培养技术把杂种细胞培养成杂种植株。（4）融合完成的标志：杂种细胞再生出细胞壁；（5）杂种细胞再生出细胞壁的检测方法：植物细胞的质壁分离与复原。5、意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。第三节动物细胞工程【基础梳理】一、动物细胞与组织培养1、动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）动物细胞培养的过程消毒（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（4）原代培养和传代培养①原代培养:直接从动物体内取出的组织块，用胰蛋白酶使其分散成单个细胞，然后用培养基配成一定浓度的细胞悬浮液，转入培养瓶中进行培养的过程。②传代培养：原代培养到一定程度，细胞会出现接触抑制，如果还要继续进行细胞培养，就要用胰蛋白酶使细胞从甁壁上脱离下来，重新分散成细胞悬浮液，分装到多个培养瓶中继续培养的过程。（5）细胞株和细胞系①细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右，细胞的分裂就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能传代40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。细胞株的细胞的遗传物质没有发生改变。②细胞系：当细胞传至50代以后不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，从而有可能在培养的条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。（6）所需条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。（7）动物细胞培养技术的应用①可有助于生产许多有重要价值的生物制品。如制备病毒疫苗、制备单克隆抗体。②可以进行有毒物质和药物的检测。③大面积烧伤或烫伤病人的皮肤移植。④培养医学研究的各种细胞，有助于细胞全能性的揭示、细胞周期及其调控等基础研究的进行。2.动物组织培养动物细胞培养与动物组织培养方法类似，主要区别是动物细胞培养过程中需要用胰蛋白酶等使组织块中的细胞离散，而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶等。二、细胞核移植技术和动物体细胞克隆1、概念:是一种利用显微操作技术将某种动物细胞的细胞核移入同种或异种动物的去除细胞核的成熟卵细胞内放入技术。2、种类哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。3、体细胞核移植的大致过程是（克隆羊为例）注：选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。4、体细胞核移植技术（克隆技术）的应用：（1）加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；（2）保护濒危物种，增大存活数量；（3）生产珍贵的医用蛋白；（4）作为异种移植的供体；（5）用于组织器官的移植等。5、体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。三、动物细胞融合单克隆抗体1、动物细胞融合（1）概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）过程：动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。