层析原理与技术

12020/7/2层析原理与方法22020/7/2内容提要1、层析原理与技术2、层析方法凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析32020/7/2层析的起源和原理•起源----1906年，俄国植物学家Tsweet•原理----利用物质分配系数不同达到分离目的0.050.0100.0%BufferB-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.4000.4500.50000:00:0001:00:0002:00:00FractionsHr:Min:SecVoltsAU层析原理Chromatography层析色谱42020/7/2什么是蛋白层析•根据蛋白分子物理化学特性的不同而达到分离–极性/疏水性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP–离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX–大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF–结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC•这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离层析原理52020/7/2分离机制•分子的大小-----凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子排阻）•分子的电性-----离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换•分子的表面疏水结构-----疏水层析（HIC），反相•其它：羟基磷灰石，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析•精制（polishing）：高分辨率层析分离机制62020/7/2层析的基本概念流动相固定相C流出组份123123洗脱峰层析原理72020/7/2层析的基本概念•固定相：固定相是层析的一个基质，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。（在柱层析中称其为层析填料。）它对层析的效果起着关键的作用。层析原理•流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体等。（柱层析中一般称为洗脱剂。）Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water82020/7/2层析方法凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析92020/7/2GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换HydrophobicInteraction疏水层析Affinity亲和层析CHT羟基磷灰石层析原理102020/7/2凝胶过滤层析/分子筛112020/7/2分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。凝胶过滤122020/7/21.Sphericalparticlespackedintoacolumn2.Sampleapplied3.Buffermobilephaseandsamplemovethroughcolumn,moleculesdiffuseinandoutofmatrix4.largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorderofsize,moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough.DiffusionBufferDiffusionintotheporesDiffusionoutoftheporesBuffer凝胶过滤132020/7/2凝胶过滤层析分离纯化原理142020/7/2Stericexclusionleadstoearlyelution•按照分子量大小洗脱•大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱152020/7/21001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP1001,8008004,0001,0006,000，用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶过滤层析凝胶的选择162020/7/2柱长的选择分离：30－120cm脱盐：30cm以下洗脱液离子强度低高离子作用排阻作用（0.1-0.5M)疏水作用pH——中性流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量：1－3％CV凝胶过滤层析操作参数选择172020/7/2•1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30•2.脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用182020/7/2凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点：1.层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从而设备成本很高；2.上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；3.工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；4.分辨率低；5.不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步，或离子交换上样前的脱盐192020/7/2离子交换层析202020/7/2离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。离子交换层析212020/7/2cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQQuaternaryamineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交换层析离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-222020/7/2pIstabilityrangestabilityrange与阳离子交换介质结合+-denaturationdenaturationpH102离子交换层析离子交换层析原理——蛋白质滴定曲线蛋白质净电荷与阴离子交换介质结合232020/7/2Products:UNOsphere™Q&S,Macro-Prep®HighQ&S,CM,DEAE,AG®resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration--++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++-----++++++++++++++++++++++++++++++------------++++++++++++++++++++++++++++++离子交换层析离子交换层析原理242020/7/2sampleapplicationandwashelutionequilibrationregeneration-----------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------anionexchangerbead离子交换过程252020/7/2离子强度洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与pH选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)缓冲液PH值：阳离子低于pI一个pH单位以上阴离子通常高于pI一个pH单位以上蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交换层析离子交换层析操作参数选择262020/7/2pI＝5.5+-pH102离子交换层析缓冲液与pHpI＝7.5阳离子交换阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋白质净电荷pH4.0pH9.0蛋白质稳定性范围272020/7/2-0.250.000.250.500.751.001.251.501.752.00AU5.506.006.507.007.508.008.509.009.5010.00pH00:00:0000:30:0001:00:0001:30:00Hr:Min:Sec134579121416Fractions-0.250.000.250.500.751.001.251.501.752.00AU5.506.006.507.007.508.008.509.009.5010.00pH00:00:0000:30:0001:00:0001:30:00Hr:Min:Sec1921242527303234FractionspH7.0-0.250.000.250.500.751.001.251.501.752.00AU5.506.006.507.007.508.008.509.009.5010.00pH00:00:0000:30:0001:00:0001:30:00Hr:Min:Sec374042444648515456FractionspH8.0-0.250.000.250.500.751.001.251.501.752.00AU5.506.006.507.007.508.008.509.009.5010.00pH00:00:0000:30:0001:00:0001:30:00Hr:Min:Sec596164676971747678FractionspH8.9pH6.000:30:0000:40:0000:50:0001:00:00Hr:Min:Sec0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.50AU-1.00-0.500.000.501.001.502.002.503.00AUpH6.0pH7.0pH8.0pH8.9缓冲液与pH的影响——阴离子交换离子交换层析离子交换层析操作参数选择282020/7/2离子交换层析离子交换层析操作参数选择盐溶液梯度的影响292020/7/2疏水层析302020/7/2•基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术•疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合•不同离子的疏水性–Anions:SO42-Cl-Br-NO3-ClO4-I-SCN-–Cations:Mg2+Li+Na+K+NH4+•蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱原理疏水层析312020/7/2疏水层析•生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合•高离子强度可加强疏水性•跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术•配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合，可用疏水层析试盒选择介质322020/7/2作用原理溶质曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG=DH-TDS332020/7/2操作参数选择疏水层析疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水疏水性强的蛋白质：甲基，丁基疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基盐：硫酸铵，醋酸铵等等缓冲体系和pH洗脱梯度342020/7/2Sample:GFPsamp