形态学实验技术

形态学实验技术组织切片制作技术石蜡切片常规染色技术石蜡切片特殊染色技术免疫组织（细胞）化学技术免疫细胞化学的理论基础免疫荧光细胞化学技术免疫酶细胞化学技术亲和免疫细胞化学技术重点介绍：电子显微镜技术（electronmicroscope,EM）1.透射电子显微镜2.扫描电子显微镜3.电镜技术与生物医学超微结构4.细胞超微结构与超微结构病理第一章组织切片制作技术第一节概述组织切片的制作技术属于组织病理学范畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某种支持物质，使组织保持一定的硬度，然后利用切片机切成薄片，经染色在显微镜下观察。根据支持物的不同，有石蜡切片、明胶切片、塑料切片、冷冻切片等类别。制成的切片捞置于载物网上，经烘干后可进行染色或备用。组织切片技术:组织的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染色等。第二节组织的处理取材固定脱水透明浸蜡与包埋一、取材（tisssueprocessing）1材料新鲜：活检组织离体后立即固定，最迟不能高于30分钟。2取材部位及切面：纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。掌握正确的取材部位就必须熟悉机体的组织结构和解剖特点，原则上应在病变与正常组织的交界处取材，避开坏死出血区。3.勿使组织受挤压：取材刀剪应锋利，切开时取材刀严禁来回挫动，以避免组织结构变形、细胞破碎。4.防止变形：固定后的组织或多或少会产生收缩现象。5.组织块力求小而薄：切块的大小、厚度及质地决定了固定的效果，一般情况下，取材大小为2×1cm，厚度为2－4mm。二、固定（fixation）固定是将某些化学试剂（固定液）渗透到需要保存或制作切片的脏器或组织、细胞中，使其所含物质尽量保持在生活状态时的形态结构和位置。固定的目的：1.迅速防止组织细胞的死后变化,防止自溶与腐败使之尽量保持生前的形态结构。2.使细胞内的蛋白质、糖、脂肪、酶等成分变为不溶性物质，以保持其原有形态及特定位置。3.能将细胞的半液体状变成半固体状，使组织变硬以利切片。4.可使组织内的各种成分产生不同的折光率。5.某些固定液可起助染作用而增进染色。固定方法浸泡固定注射、灌注固定微波固定蒸汽固定常用的固定剂单纯性固定剂：甲醛（福尔马林formalin）乙醇；乙酸。混合固定剂：中性甲醛pH7.0（甲醛、磷酸缓冲液）；A-F液（甲醛、酒精）三、脱水（dehydration）将组织内的水分用某些化学试剂置换出来的过程。脱水的目的标本经固定和水洗后，组织内有大量水份，不能与二甲苯混溶，因此必须脱水。常用的脱水剂和脱水方法脱水剂有：乙醇、丙酮等80％酒精30分钟95％酒精1－2小时95％酒精1－2小时100％酒精1－2小时100％酒精1－2小时四、透明（clearing）为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡包埋前的一个特定步骤。透明的目的：便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡）相混溶，起到桥梁作用。大多数脱水剂不能和包埋剂（石蜡）混溶，故必须通过透明剂置换出脱水剂后才能进行后续程序。常用的透明剂二甲苯：为最常用的透明剂，有毒、易燃、易挥发；沸点1380C-1400C,长期接触对粘膜有刺激作用。氯仿:易挥发微溶于水，易溶于醇、醚、苯等。它比二甲苯透明力差，但不宜使组织变脆，是大块组织的良好透明剂常用的透明方法二甲苯透明法（常用）：彻底脱水的组织块二甲苯1二甲苯2，此二步总的时间不超过40分钟。氯仿透明法：彻底脱水的组织块按3：1氯仿、纯酒精混合液1小时氯仿1-2小时1：1氯仿石蜡混合液1小时。五、浸蜡与包埋浸蜡(paraffininfiltrating)和包埋(embedding)是指标本经过前期处理后，再置于支持物中，使支持物透入组织内部，并将组织埋入、包裹的过程。常用的支持物有明胶、石蜡、火棉胶、树脂、炭蜡等，他们既是浸透剂又是包埋剂。其中最常用的是石蜡。浸蜡的方法此法应在560C－620C的温箱内进行，液状石蜡的量应为标本的25－30倍。方法：透明后的组织520C－540C（软蜡）1小时540C－560C石蜡1小时580C－600C（硬蜡）1小时540C－560C石蜡进行包埋第三节组织切片切片（section）1.整修蜡块：组织四周应留有2－4mm蜡边，蜡块的上下两边应平行。2.镶装：镶装平面应尽可能与切片刀刃平行。3.调整：切片机的进度尺常定在4－6μm，切片刀的倾斜角在20度左右。4.修切平面：修切的组织片不能过厚，以免造成组织块的人为损失，标准为15μm／次。5.切片：要求质量，左手毛笔，右手眼科镊，转速均匀。6.展片、捞片：常用水温为450C左右，组织膜与玻片附着的位置为，右手持片，玻片的左2／3正中。7.烘片：烘烤箱的温度为630C以下，时间常为12小时。第二章石蜡切片常规染色技术第一节概述染色的意义及目的:染色（stainning）是用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于光镜观察和分析。组织染色属于生物染色的范畴。染色种类：包括普通染色、特殊染色、单一染色、多色染色等。第二节苏木素—伊红染色（HE染色）苏木素（haematoxylin）又称苏木精，一种天然碱性染料，对细胞核具有优良的染色能力。伊红Y（eosin）又称曙红Y,简称伊红，属酸性染料，是良好的细胞质染色剂。苏木素(haematoxylin)—伊红染色法，简称HE染色，是医学领域中最广泛应用于细胞和组织的染色方法，也被称为常规染色。一、HE染色的基本原理细胞核染色的原理：细胞核主要由DNA构成，带负电荷，呈酸性，易于带正电荷的碱性染料结合。细胞质的染色原理:细胞之内主要成分是蛋白质,为两性化合物，细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。必须将pH调至等电点以下时，再染液中加入醋酸使胞浆带正电（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y:是一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电的阴离子，与蛋白质的带氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染成红色。二、染色方法1.自温箱中取出切片后，立即放入二甲苯①、②中脱蜡各5分钟。2.入纯酒精1、2中各5分钟以洗去二甲苯。3.入95%酒精和80%酒精中各5分钟。4.入自来水洗涤（水化）。5.入苏木素染液5-10分钟。6.自来水洗。7.0.5-1%盐酸酒精分化数秒钟。8.充分水洗蓝化30分钟。9.0.5-1%伊红1-2分钟。10.80%、95%、纯酒精1、2(脱水)各5分钟。11.二甲苯1、2中(透明)各5－10分钟。12.中性树胶封固。HE染色中二甲苯、酒精和水洗作用：1.二甲苯的作用:二甲苯可以洗去石蜡，使染料更易进入到细胞和组织内；染色后的二甲苯起透明切片的作用。以利于光线的透过。2.酒精的作用:酒精用于苏木素染色前由高浓度向低浓度逐渐下降处理切片,洗脱用于脱蜡的二甲苯。酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。梯度酒精(95%,80%)使水分逐渐进入切片，以免引起细胞形态结构的人工改变。伊红染色后的梯度酒精(80%,90%,95%,100%)是为了逐渐脱去组织中的水分,为二甲苯进入细胞(透明)创造条件。否则切片组织不能显示清晰的细胞和组织结构。3.水洗:水洗是为了使苏木精进入细胞核内，使细胞核着色；染色后的水洗是为洗去未与切片结合的染液；分化后的水洗是为了除去分化液和脱下的染料。HE染色中分化和蓝化的作用：1.分化作用:苏木素染色后,水洗去未结合在切片中的染液,但细胞核内结合过多的染液和细胞浆中吸附过多的染料必须用分化液(1%盐酸酒精）脱去，以保证核与浆的染色分明。将此过程称为染色的分化作用。但不能过度。2.蓝化作用:当分化以后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于兰色离子状态。所以分化后用水洗去酸而中止分化，也可用稀氨水或温水变蓝。此过程称蓝化作用。第三节组织切片特殊染色(Masson三色染色)为了显示组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变、病原体等，需要选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色，这些是常规染色所不能的。故称特殊染色。如细胞中的黑色素或含铁血黄素的区别，用特殊染色即可做到。结缔组织含有三种纤维，即胶原纤维、网状纤维和弹力纤维。这三种纤维广泛分布于身体各处，常见于器官与器官之间，组织与组织之间以及细胞和细胞之间，这些纤维具有支持、连接、营养、防御、保护和创伤修复等功能，在H.E染色中有时难以区别，特别是在某些病理改变时，则要借助于特染鉴别。特殊染色的方法很多，在此仅介绍胶原纤维染色。显示胶原纤维的方法很多，最常用的是Masson三色染色和V.G染色。应用：判定多种组织、器官的病变程度及修复情况；区分肿瘤组织中的纤维与平滑肌成分。Masson三色染色技术操作Masson复合染色液：酸性复红、丽春红、橘黄G、醋酸亮绿染色液（可用苯胺蓝替换）：亮绿、醋酸染色过程：1.切片脱蜡至水2.苏木素染5分钟,水洗3.盐酸酒精分化,水洗4.染于丽春红复红液5分钟,水洗5.磷钼酸水溶液分化5分钟,水洗6.染于亮绿2-5分钟7.脱水、透明、封固结果判定:胶原纤维呈绿色或蓝色，肌纤维、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。脑尼氏体星形细胞肾淀粉样变刚果红染色肝表面抗原维多利亚蓝第三章免疫组织（细胞）化学(immunohistochemistry,IHC)第一节免疫组织化学概论免疫组织化学是利用免疫学抗体与抗原结合的原理及组织化学技术对组织、细胞特定抗原或抗体进行定位和定量的技术，是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科。若想学好免疫组织化学，必须先了解与之相关的免疫学基础。免疫组织化学主要原理是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其用免疫细胞化学手段检出和研究。乳腺导管癌ER细支气管肺泡癌TTF-1免疫细胞化学的突出优点是：1.高度的特异性抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。2.敏感性高免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物的抗原性，采用多种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。3.方法步骤统一虽然免疫组化技术的方法很多，但基本程序相同只要掌握了原理和一种方法，其它方法大同小异。4.既可定位、定性又可定量免疫组化技术用于组织或细胞成分定性、定位及定量的研究有关的免疫学理论一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系抗原(Antigen)凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特性称为抗原性。抗原可以是可溶性物质（如病毒和蛋白质）或微粒（细菌或组织细胞）。也可有外源性和内源性之分。抗体(Antibody)是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)。含有免疫球蛋白的血清称免疫血清。人类免疫球蛋白有五类即IgG,IgM,IgA,IgE,IgD。抗体的种类：根据获得抗体的途径或来源不同分类免疫抗体，天然抗体，自身抗体，完全抗体，不完全抗体。抗原与抗体的关系抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因，决定免疫反应的特异性，机体与抗原物质的斗争过程中为加速循环和排除抗原而产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质，是机体排除异体物质的保护性反应。没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；利用抗体可以检测抗原物质。二、免疫细胞化