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革兰氏染色法的原理及其练习摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。本实验主要对大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach）、枯草杆菌（Bacillussubtilis）进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureusRosenbach）多组呈现假阴性。本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染色得多加练习。本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。关键词：革兰氏染色大肠杆菌(E.coli)金黄色葡萄球菌(S.aureusRosenbach)枯草杆菌(B.subtilis)引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌，金黄色葡萄球菌(S.aureusRosenbach)与枯草杆菌(B.subtilis)都是革兰氏阳性细菌，染色后在显微镜下容易区别。同时它们的形态各异，可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。本实验还涉及到高倍油镜的使用。使用油镜与用一般的镜头不同，具体使用在实验方法中描述。1.1材料1.1.1菌种大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。1.1.2溶液与试剂无菌生理盐水，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染夜，香柏油，二甲苯1.1.3仪器酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶，接种环，滴管等1.2方法1.2.1制片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不要太厚）、干燥和固定。1.2.2染色（1）初染：滴加草酸结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色2min，水洗至流出水无色。（2）媒染：用卢戈氏染液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。（3）脱色：将玻片上的水用吸水纸吸取，用滴管流加95%乙醇脱色（持续20秒），稍后立即洗去乙醇。（4）复染：将玻片上的水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水烤干。1.2.3镜检分别用香柏油覆盖涂菌部位，先用低倍镜找到菌，换用的物镜观察染色情况。观察结束后，用二甲苯擦洗镜头。2．实验结果与分析2.2结果分析大肠杆菌竟革兰氏染色后呈现红色，3个图片上都是红色，因此大肠杆菌应该是革兰氏阴性细菌，与事实相符，染色成功。金黄色葡萄球菌比较难染色，从结果中可以分析，前两个涂片的菌种可能培养的时间太长了。因为老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性，老龄的G+细菌细胞壁老化，不能在乙醇处理的时候使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，从而在复染时被染红。枯草杆菌染色结果很好，蓝紫色很明显，染色成功。1.3.3小结1、获得本实验成功的关键：固定时烘烤要适度，太轻会在冲洗时冲走细菌，过度会破坏细菌形态；脱色的时间要严格控制，脱色不够造成假阳性，脱色过度会出现假阴性；选用新培养的菌种，涂片时不能太厚。这些问题在实验过程中几乎都有出现，尤其是对于初学者，特别需要注意。2、革兰氏染色可以迅速将细菌分为阴性和阳性，是很重要的染色方法，也是相当复杂的染色方法。通过练习革兰氏染色，既掌握了一般的染色方法，又为以后技术要求更高的染色，观察，鉴别奠定了基础。