搜索
前言:由于实验室经费问题(我想很多实验室都有这个问题,毕竟很多时候我们没有老外足够的经费),我决定利用DNALADDER来证明(当然还辅助其它的方法)经过药物处理的细胞发生了凋亡还是坏死,所以一直研究DNALADDER方法,自己曾经看了文献中的很多方法,自己也尝试了一下,发现还是最经典的是最好的!在整个实验过程得到了wscoco78等战友的大力帮助和建议(下面方案中有一些是wscoco78的原话,表示感谢!),并最终成功了,回顾这一段经历,感觉对自己的科研态度和科研方法都很有启发,整理了一下资料,希望与大家共享!也希望大家能够把自己好的成功方法也贴上来,大家一起努力,相信没有做不好的实验!如果大家有什么这方面的问题,可以发信至:biochujun@126.com,我会解答大家的问题的!也希望大家批评指正!注:黑色字体部分为细胞实验指南P108~109的内容(完全一样),其中红色部分为我的改动以及一些建议,希望您能成功!三、DNA裂解分析凋亡的标准特征之一，是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。由于该技术只能提供细胞死亡的定性分析，一般要结合定量的方法以确定样品的凋亡程度。另有需注意的重要之处，一些细胞类型或细胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡时不是以此种方式断裂DNA，另外在坏死细胞中也不发生这样的DNA裂解。这不是凋亡细胞的限定性试验，但不论在何系统中，这都是确定细胞死亡有用的特性。DNA裂解测量有几种方法，包括FACS分析和完整的标记DNA的检测。另一种方法TUNEL，需DNA末端标记，用于单个细胞DNA裂解的测定。凋亡常常伴随有DNA的裂解，这些技术在凋亡测量中都有意义。(一)琼脂糖凝胶电泳1)将5×105细胞移人无菌的1.5-mlEppendorf管中，4℃2000r／min离心5分钟，弃上清。注意不要使用过多的细胞，否则随后的酶解可能不完全，形成很黏稠的DNA溶液。储军注:①细胞接种数:我一般是将细胞按照5×105细胞/35mm平皿接种,然后培养两天(因为接种后的细胞有部分会死亡,所以培养一天的细胞可能会少,个人觉得培养两天比较合适,细胞不要太多了!!!!),然后再加药物处理,处理时间看您药物的类型和剂量,不过建议您做几个梯度,同时进行,这样可以看出剂量和时间对细胞凋亡的影响程度,我当时做的是每隔8h,测量一次,太累,建议您每隔12h或者24h测量一次②离心速度:我是4℃2000r／min离心5分钟,按照我实验室离心机换算RCF(相对离心力)为367g③细胞收集:贴壁细胞需要把漂浮细胞和贴壁细胞（胰酶消化）一起收集，离心，然后用预冷的PBS再洗涤一次,注意丢弃上清液要小心,注意不要把细胞吸走了,我一般使用1ml和0.1ml两个移液枪来操作的,1ml取走大部分上清夜,0.1ml把剩余的小心取走!2)加入20µl溶解缓冲液[20mmol/LEDTA，100mmoll/LTris，pH8.0，0.8％(w/v)SDS]。用移液管尖混匀细胞沉淀。小心：SDS(见附录5)不要形成强的旋涡，因为高分子量DNA可能被剪切。储军注:①加入溶解缓冲液前:虽然上清液被丢弃,但是一般在管底还是有少量上清液,此时可以用食指轻弹管底,使得细胞沉淀尽可能融解,为加入溶解缓冲液后混匀创造条件。②溶解缓冲液的配制:把EDTA,Tris-base,SDS放在一起搅拌混匀，使用pH计测得其pH值大概在8.0左右，根本不需要加HCL调pH值!只要你的试剂好（fluka、amresco、sigma），照这些经典方法基本上都不需要调pH值，真的很准，上下0.5而已。③混匀细胞沉淀:有了①,这步应该可以很好做了,把枪尖浸入液面下，部分按下按钮(很重要,否则溶液里有很多气泡,导致溶解缓冲液没有充分混匀啊!)，只是形成暗流，在液面下涌动，气体不放出来自然无气泡!3)加10µlRNA酶A/T1混合液(分别为500U/ml，20000U／ml，AmbionInc．)，轻弹管尖混匀，不要形成旋涡。37℃孵育30-120分钟。储军注:①混匀:方法同2)②我采用37℃孵育120min,也采用过90min,效果一样③RNA酶A/T1混合液:我只是配了500U/ml的RNA酶A,不需要T1,效果也是很好!,而且我的RNA酶也没有进行煮沸处理,不过最好是处理一下了!④将封口膜将EP管封好,以免EP管中的液体蒸发4)加10µl蛋白酶K(20mg/ml，Ambion)，轻弹管尖混匀，50℃孵育至少90min，也可过夜。储军注:①在加蛋白酶K之前,轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底②我采用55℃水浴,时间曾用过3h,4h,6h,过夜,效果差不多,根据您自己的个人时间决定,比如你现在需要陪MM看碟了,就让它过夜吧,没关系的了!③加入蛋白酶K后，溶液立即出现絮状白色物，蛋白酶K是冷的缘故，加到37℃的裂解液自然会出现絮状物，再涌动涌动（同2））,然后再放入55℃一段时间就消失了，不是什么怪现象④将封口膜将EP管封好,以免EP管中的液体蒸发⑤做完后,轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底,这时可以进行电泳或在-20℃保存以后跑电泳5)加5µl6×DNA加样缓冲液(30％甘油，0．25％溴酚蓝)，在含0.5µg/ml溴化乙锭TAE的1％-1.5％琼脂糖凝胶干孔中加DNA样品。小心：甘油；溴酚蓝；溴化乙锭(见附录5)为了避免由于某些制备液黏稠而致DNA样品损失，推荐加样应在干孔中(电泳池中加入缓冲液之前)。参考加样量为100bp大小。储军注:①胶浓度:1%/1.5%的我都用过,但是发现效果不好,建议使用2%,我就是用的2%②电泳相关参数:最好选择2～4V/cm电压，用大的电泳槽（10cm以上）,我使用23cm电泳槽,电压为45V,跑6h30min③加样缓冲液:我一般每孔加20µl样品+4µl10×loadingbuffer(加液缓冲液用量加倍了,主要是为了使样品中的DNA样品能否充分沉积在孔中)6)低电压电泳，可以促进DNA片段的分离(如35V，4小时，或至染料泳动到2/3处)。储军注:①当胶放入电泳槽后,小心加TAE,以免孔中的样品流到外面②跑电泳过程,注意不要跑歪了,不时调整一下电泳槽的水平7)DNA序列梯最后有紫外光显示，摄影。凋亡细胞形成明显的DNA梯度，而坏死细胞为不清晰的成片条带(或无DNA裂解)。活细胞DNA在胶顶部，是一个高分子量条带。凋亡并不都能形成梯度，这取决于所研究的细胞类型。另外，坏死细胞在某些情况下能产生梯度。凋亡中如发生DNA裂解，通常会失去膜整合性。如因生存力丧失梯度形成明显迟缓，则不像是凋亡发生。储军注:我一般泡20minEB吧,然后将它在水龙头下轻轻漂洗4~5遍,然后开始照相了,最好使用凝胶成像系统进行拍照,这样效果好,数码相机效果不是特别好注意事项·建议使用宽口移液管移取基因组DNA，以避免DNA的剪切。宽口吸头可从商业途径获得，或将200µl吸头尖切掉而制得。吸头应高压灭菌，避免DNA酶污染。可以不在琼脂糖凝胶中直接加入溴化乙啶，而是电泳后用含1µlg/ml溴化乙啶的TAE缓冲液染1小时，用水脱色后进行DNA显色。储军注:我第一次做DNALADDER实验时,是自己做的宽口吸头,但后来发现其实没必要,直接使用已灭过菌的tip头效果一样,只要在操作过程小心就行了!实验结果如下(一)细胞凋亡结果说明:细胞为SP2/0（鼠骨髓瘤细胞），10ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析.凝胶两端为lamdamarker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是连续奋斗了三个晚上啊，好累，不过值得，结果非常不错！：）随着时间的累积,细胞凋亡程度在加大,一切都很明显!(二)细胞坏死结果说明:细胞为SPC-A1（人源肺癌细胞），10ug/ml顺铂（终浓度）处理，每隔8h，进行分析.凝胶两端为lamdamarker，从左至右分别为空白（未用顺铂处理），处理8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h，我可是连续奋斗了三个晚上啊，好累，不过值得，结果非常不错！：）.随着时间的累积,细胞坏死程度在加大,一切都很明显!说明:本来不想将结果列出的,有点怕有人将我的结果当作自己的成果,我不希望有这种情况出现,毕竟造假是不道德的!祝大家新年快乐!实验顺利!储军2004-1-9于华中科技大学【求助】DNA琼脂糖凝胶电泳方法我准备做DNA琼脂糖凝胶电泳,请教下列几个问题:1.RNA酶－A/T1混合液中A/T1是什么,它有什么作用?2.离心后DNA是存在上清液中还是在沉淀中?3.将上清液在等体积的苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1异丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次.这一步的作用是什么?4.在上清液中加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积的冷无水乙醇，－20℃静置过夜.这一步作用又是什么?另:如有全面的操作过程请公布一下!非常感谢!2.2.1.1细菌中质粒DNA的制备碱裂解法小量制备质粒DNA1)挑取培养基上的白色单菌落，接种于5ml含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；2)取1.5ml菌液于小离心管中，13000rpm离心1-2min，富集菌体，重复一次；3)菌体沉淀重悬于300ul溶液I中，振荡混匀；4)加入新鲜配置的300ul溶液II,上下颠倒混匀，冰上放置10min；5)加入300ul溶液III，轻轻旋转混匀，冰上放置5分钟；6）室温13000rpm离心15min；7)取上清，加入等体积的Tris-中性酚,混匀后13000rpm离心10min；8)取上清，再用等体积氯仿抽提一次；9)取上清,加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀至少5min,-20℃放置30min；10）13000rpm离心15min；11）弃上清,抽干后溶于适量双蒸水中。质粒提取所需的溶液：溶液I：50mmol/LTris-Hcl(pH7.5)；10mmol/LEDTA(pH7.5)；125ug/mlRNaseA;溶液II：0.2mol/LNaOH;1%SDS；溶液III：1.32mol/LKAC＂苯酚1氯仿（1:1）、苯酚1氯仿1异丙醇（25:24:1）和氯仿中各提取1次＂使蛋白质变性和抽提蛋白的作用．＂在上清液中加入1/10体积3mol/L醋酸钠＂使碱裂解变性质粒ＤＮＡ复性，而基因组ＤＮＡ由于过大而不能及时复性而和蛋白一起缠绕沉淀．＂２倍体积的冷无水乙醇，－20℃静置过夜＂是充分洗除残留的苯酚／氯仿和使质粒ＤＮＡ沉淀的作用．至于＂RNA酶－A/T1混合液中A/T1是什么,它有什么作用?＂中的A/T1我没有听说过，也不知道是什么东西．基本同意楼上的观点稍作补充：1.RNA酶－A/T1混合液应该是含有胰RNA酶（RNA酶A)的Tris溶液，胰RNA酶用于除去RNA的污染。2.离心后DNA存在于上清中3.酚-氯仿是用来使蛋白变性抽提蛋白的，氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚，因为酚具有水溶性，这一步具有提纯的作用，如果你对DNA样品的纯度要求不是很高，氯仿抽提这一步可以省略。4.加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积的冷无水乙醇是为了更好的沉淀DNA