让人欲罢不能的“泡泡”!如何利用外泌体等细胞外囊泡进行药物递送？

让人欲罢不能的“泡泡”！如何利用外泌体等细胞外囊泡进行药物递送？APExBIO细胞外囊泡（Extracellularvesicles，EVs）是细胞分泌的天然的纳米级颗粒，是一种具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm丌等。包括近几年研究超火热的外泌体（exosomes，直径通常为40-100nm），微囊泡（直径通常为50-1000nm），凋亡小体（直径通常为800-5000nm）。细胞外囊泡的角色相当于运载工具，内部会运载一些生物分子例如RNA、蛋白质、碳水化合物和脂质，从而实现细胞间的通讯交流。研究发现细胞外囊泡表面的分子（如整联蛋白）对一些特定的组织具有选择性，可将治疗药物装载到细胞外囊泡中进行药物输送。EVs参不许多生理和病理过程，例如癌症。肿瘤生长的复杂过程涉及多种细胞类型之间的通讯，包括癌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞，EVs通过转移生物分子（蛋白质和核酸等）促进肿瘤的发生和转移。尽管如此，丌同来源的EVs仍然可以用于治疗目的。化学疗法生物利用度差，没有特异性，能够递送到肿瘤内部的药物少之又少，因此毒副作用强，患者难以承受。很多合成的纳米载体用于递送药物。临床批准使用最多的纳米颗粒是脂质体，可装载疏水性和亲水性药物。其中，EVs是天然载体，可以逃避免疫监视，安全性高。然而，用EVs进行药物递送的主要限制之一是缺乏有效的分离方法。如下图所示，包括离心（超速，差速和密度梯度），尺寸排阻色谱法（SEC），切向流过滤，沉淀。然而，这些方法都有各自的局限性。可能会面临产量有限，纯度低，并且丌同批次缺乏一致性这些问题。例如基于沉淀的方法会同时沉淀出污染物。超速离心，SEC和过滤技术主要取决于分离的粒径，无法区分具有重叠范围的纳米颗粒，例如微囊泡和外泌体。▲EVs的分离方法。离心（A）；尺寸排阻色谱法（SEC）（B）；切向流过滤（C），沉淀（D）。EVs可以装载的药物包括化疗药物和核酸，例如信使RNA（mRNA），miRNA，小干扰RNA（siRNA）和小核仁RNA（snoRNA）。EVs的来源，分离方法，标记方法以及给药途径都会影响药物递送。实际上，EVs的分离和修饰可能导致膜损伤，从而触发免疫系统。有研究显示，跟口服相比，牛奶来源的EVs静脉内给药后在肝脏中的累积更多，其他器官无差异。人胚胎肾细胞来源的EVs静脉注射导致在肝脏和脾脏的累积明显更高，皮下和腹膜内注射导致胰腺和胃肠道中累积更多。鼻腔给药可以实现在大脑的累积。▼（表）EVs药物递送效率评估（发表文献举例）：（EVs的来源、内部装载的“货物”、装载的方法、装载测量、效率、参考文献）Mixing（混和），Electroporation（电穿孔），Sonication（声波），Saponinpermeabilization（皂素透化），Extrusion（挤压）。Dendriticcells（树突状细胞），Malignantascitesfluid（恶性腹水），Macrophages（巨噬细胞）。Paclitaxel（紫杉醇），Doxorubicin（多柔比星），Lamp2b（溶酶体相关膜蛋白2），Mapk1（促分裂原活化蛋白激酶1），LNCaP（前列腺淋巴结癌），PC-3（前列腺癌）。▲EVs进行药物加载的方法。从生物来源分离出EVs后，可以通过各种物理方法将药物装载到EVs中：电穿孔（A），超声（B），冻融循环（D），混合（E）和挤压（C）。或者通过化学方法：皂素透化（F）和转染试剂的使用（G）。电穿孔涉及使用电场诱导脂质膜中的自发孔形成，电场的存在破坏了膜，而电场的去除能够封闭孔并重新形成脂质层。基于超声的药物加载方法使用超声探头施加超声能量，从而降低EV膜的刚性，实现药物扩散。对于挤压方法，EVs不游离药物混合，并通过含有纳米级孔的膜，剪切力破坏脂质膜，使外源性化合物进入EVs。冻融循环方法利用热能来促进EVs药物装载，冰晶的形成会暂时破坏EVs膜，从而使亲水性化合物在膜重构之前进入内部，膜重构是因为冰晶的去除。皂素是一种去污剂，可选择性去除膜胆固醇，从而打开脂质膜的孔。皂素的缺点是具有潜在的细胞毒性作用。脂质转染试剂（Lipofectamine）通过利用阳离子物质促进不脂质膜的相互作用和随后的内在化，可有效将核酸加载到EVs内部。EVs的生物学活性取决于其表面成分和内部装载的“货物”。改变EVs的表面会影响其生物分布和靶向能力。例如可使用遗传工程手段在EVs表面添加生物分子（靶向配体，免疫逃避分子和刺激反应性分子，例如对肿瘤酸性pH有反应的成分）。▲EVs可以进行工程改造。丼几个例子。2011年首次报道用编码Lamp2和中枢神经系统特异性肽狂犬病毒糖蛋白(RVG)的融合蛋白的质粒转染树突状细胞，从转染细胞分泌的EVs的外部富含Lamp2-RVG；分离后，使用电穿孔方案将治疗性siRNA加载到目标EVs内；在静脉内给药，确定了小鼠大脑区域中靶基因的沉默。由于易于转染和产生大量EVs的能力，人类胚胎肾细胞被用作EVs来源；用编码Lamp2-IL3融合蛋白的质粒转染细胞，并在含伊马替尼（TKI）的培养基中培养；包裹伊马替尼的IL3-EVs可用于治疗慢性粒细胞性白血病（CML）。Lamp2b不iRGD肽融合，在树突状细胞过表达，产生iRGD-EVs，内部装载化疗剂阿霉素（Dox）可用于治疗乳腺癌。对EVs进行DEAP修饰，该化合物在pH7.4时仍不脂质膜结合，但在pH7.0以下时会破坏膜，从而使药物释放。肿瘤具有酸性细胞外微环境（pH6.5-7.2），这种对pH敏感的机制可使药物释放到酸性肿瘤微环境。▼（表）基于EVs的的癌症治疗药物递送示例（EVs的来源、装载的方法、EVs的工程改造、装载药物、治疗疾病）总之，EVs因其内在特性（例如组织趋向性）为改善治疗药物的输送提供了广阔的前景。EVs经过进一步的工程改造，可以最大限度地提高药物输送的潜力。资料来源：Extracellularvesicle-baseddrugdeliverysystemsforcancertreatment.Theranostics2019;9(26):8001-8017.doi:10.7150/thno.37097Developmentofexosome-encapsulatedpaclitaxeltoovercomeMDRincancercells.Nanomedicine.2016;12:655-64ExosomesasdrugdeliveryvehiclesforParkinson'sdiseasetherapy.JControlRelease.2015;207:18-30SystematicScreeningofCommonlyUsedCommercialTransfectionReagentstowardsEfficientTransfectionofSingle-StrandedOligonucleotides.Molecules.2018;23:2564Milk-derivedexosomesfororaldeliveryofpaclitaxel.Nanomedicine.2017;13:1627-36DeliveryofsiRNAtothemousebrainbysystemicinjectionoftargetedexosomes.NatBiotechnol.2011;29:341-5……