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信号转导蛋白质分子的生物化学基础二、蛋白质的理化性质与分离、纯化（一）理化性质1.两性电离与pI颗粒表面电荷水化膜2.蛋白质胶体性质3.蛋白质的变性(denaturation)尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性天然状态，有催化活性4.紫外吸收性质5.蛋白质呈色反应（定量）（1）茚三酮反应（2）双缩脲反应（Biuret法）（3）Lowry法（Folin酚法）（4）BCA法（二喹啉甲酸法）微量检测可达到0.5μg/ml（5）Bradford法（6）Kjedathl法不同定量方法比较方法波长（nm）适用范围影响因素双缩脲法5400.5-10g/L硫醇、TrisLowry法65020-400mg/L硫醇、Tris紫外吸收法2800.1-0.5mg/L核酸Bradford法（考马斯亮蓝）5950.05-0.5mg/L甘油、去污剂、硫酸铵、Tris等多种BCA法5620.05-0.5mg/L胶体金法520-5800.001-0.01mg/L蛋白质纯度、含量、胶体金颗粒等(7)蛋白印迹（WesternBlot）在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用多肽的特异抗体来检测。WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜（转移电泳）封闭（抗原封闭）一抗杂交二抗杂交底物显色膜的封闭（防止非特异杂交）抗体杂交（为标记Ab1，再加标记Ab2）检测：（化学发光、化学显色、放射性核素、荧光底物等）（二）蛋白质提取、分离1.透析及超滤法2.丙酮沉淀与盐析如血清白蛋白球蛋白在pH7半饱和硫酸胺：溶解沉淀饱和硫酸胺：析出3.免疫沉淀法4.电泳法分离电泳(elctrophoresis)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向凝胶电泳SDS-pag等电聚焦电泳双向凝胶电泳国家自然科学基金30070914实验设计理论支持优点1.中药作用机制研究分类；2.采用细胞周期做切入点（中药研究中少见）3.自然衰老SD雄性大鼠；不足：用药组分类模糊：非传统用药方剂；非单味中药；非有效成分；设计重要缺陷1.忽略cyclinD/E与CDK结合而抑制CDK；2.周期调控中Rb磷酸化的重要作用；3.DNA损伤重要线索4.细胞周期直接证据；5.用药量（三药合一）；6.统计分析；•1．先用小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂量，一般可取1/10-1/5。2．植物药粗制剂的剂量多按生药折算。3．化学药品可参考化学结构相似的已知药物，特别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。4．确定剂量后，如第一次实验的作用不明显，动物也没有中毒的表现（体重下降、精神不振、活动减少或其他症状），可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。半数致死量（LD50）和最大耐受量（Maximaltolerancedose,MTD）：测定，MTD指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量5．确定动物给药剂量时，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。一般说确定的给药剂量是指成年动物的，如是幼小动物，剂量应减少。如以狗为例：6个月以上的狗给药量为1份时，3-6个月的给1/2份，45-89日1/4份，20-44日的给1/8份，10-19日的给1/16份。7．确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同，以口服量为100时，灌肠量应为100-200，皮下注射量30-50，肌肉注射量为25-30，静脉注射量为25。•8.确定给药上限(最大给药量）和剂量（1/2-中剂量、1/4小剂量）实验动物用药量的计算方法1.按mg/kg体重或g/kg体重计算；2.一般说来，动物的耐受性要比人大，将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算：人用药量为1，小白鼠、大白鼠为25-50，兔、豚鼠为15-20，狗、猫为5-10。3.以LD50、MTD确定5.层析分离常用的层析方法（1）离子交换层析（2）凝胶过滤(gelfiltration)6.超速离心分离超速离心法(ultracentrifugation)蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。（三）常用样品蛋白质的获取原料选择（组织、培养细胞）前处理（细胞破碎：物理、化学、机械）前处理（细胞器分离）分离纯化（选取分离方法）1.弃去培养基用PBS洗2次后，加入冷的裂解液，裂解液配方：50mMHepes,150mMNaCl,3mMMgCl2,调整pH至7.5,根据需要加入蛋白酶抑制剂。2.在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞，转移裂解液至EP管，用21号针头反复吹打裂解细胞。3.1000g，3min离心，将上清转移至另一EP管(A管)，沉淀用适量含1%SDS的裂解液（上述裂解液加入SDS）溶解即可得到核蛋白。4.将A管上清21460g，1h4°C离心，即可得到胞浆蛋白（上清）和胞膜/骨架蛋白（沉淀）。对于沉淀根据需要有两种处理，A.将沉淀用含SDS的裂解液溶解，即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。B.将沉淀用含TritonX-100裂解液(100mMphosphatebuffer,150mMNaCl,measuredpH8,1.5%TritonX-100,10%glycerol,plusinhibitors)溶解，即可得到溶于TritonX-100（Sol）的胞膜/骨架蛋白，转移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解，即可得到不溶于TritonX-100（Insol）的胞膜/骨架蛋白。5.培养细胞的蛋白提取三、多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因测定DNA序列排列出mRNA序列质谱分析蛋白质的一般步骤氨基酸分析仪四、空间结构测定二级结构测定圆二色光谱(circulardichroism，CD)-螺旋的CD峰：222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；三级结构测定X射线衍射法(X-raydiffraction)核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)