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:100730##陈民钧针对当前我国抗生素耐药的发展现状,笔者将围绕下呼吸道感染肺炎的微生物学诊断的难度苛养菌监测等注意事项,以及今冬明春微生物实验室,如何协助临床排除传染性非典型肺炎(SARS)病例,作一介绍和评述一非发酵糖革兰阴性杆菌的耐药现状临床经验性选择有效的抗生素时,必须了解本地区耐药细菌的流行动态医院内病原菌耐药监测项目(简称NPRS)是由美国默克研究中心牵头的一项全球性监测网络,它主要研究医院重症感染病人中分离的革兰阴性菌的耐药状况全国35家医院总结的NPRS监测采用先进的浓度梯度(Etes)法测定B内酰胺类氟喹诺酮类氨基糖苷类等12种常用广谱抗生素最低抑菌浓度(MICs),其结果总结发表于2003年中华医学杂志[1,2]1994~2001年4450株非发酵糖细菌的耐药变迁很有代表意义主要的非发酵糖细菌为绿脓假单胞菌(4619%)不动杆菌属(3110%)嗜麦芽窄食单胞菌(912%)产碱杆菌属(117%)黄杆菌属(117%)洋葱伯克霍尔德菌(115%)近3年中,非发酵糖细菌的比例从4112%升高到4719%7年中10种抗菌药物的敏感性均在下降,敏感率是头孢哌酮/舒巴坦7816%亚胺培南77%头孢他啶7011%哌拉西林/三唑巴坦6915%阿米卡星6919%头孢匹肟63%环丙沙星5911%;针对绿脓假单胞菌的亚胺培南头孢他啶的敏感率从1994年的96%92%分别降至2001年的75%79%,两药的MIC90分别升高16倍和8倍;其他抗生素的敏感率降低2~10个百分点[2]亚胺培南对不动杆菌的活性最高,且历年不减,2001年仍高达96%,MIC50和MIC90分别为0125Lg/ml2Lg/ml头孢哌酮/舒巴坦活性从1996年的88%降至2001年的69%,头孢他啶头孢匹肟哌拉西林/三唑巴坦替卡西林/克拉维酸庆大霉素环丙沙星的敏感率只有45%~58%[3],对嗜麦芽窄食单胞菌的头孢哌酮/舒巴坦头孢他啶替卡西林/克拉维酸的敏感率最高,并且在7年中仍保持较高的活性,前2个药的敏感性均在85%以上,后者的敏感性从1994年的53%升至2001年78%王辉等[3]研究不动杆菌的耐药性发现耐亚胺培南株较少,2001年为319%,但其他多重耐药株在增加;耐亚胺培南的9株与多重耐药株为一个克隆株;均有OXA-23型酶,但无VIM及IMP酶黄支密等[4]研究了浙江湖州地区60株鲍曼不动杆菌的耐药性,它们对亚胺培南美洛培南的耐药率很低为117%,哌拉西林/他唑巴坦的耐药率为4813%,对其他抗菌药物的耐药率均在50%以上有18株菌株扩增到SHV型B内酰胺酶,17株为SHV-12,另1株为SHV-48很可惜的是由于PCR引物缺少,常见的OXA-VEB-PER-未测出姚苹等[5]发现80株不动杆菌中2株与大肠埃希菌的TEM76,84同源性98%的超广谱B内酰胺酶(ESBLs)二革兰阴性杆菌的耐药问题与ESBLs和AmpC酶的调查当前革兰阴性杆菌的耐药问题[1]中首当其冲的是质粒介导的ESBLs和染色体介导的AmpC酶临床意义重大的ESBLs类别和数量年年在增加我国ESBLs在常见革兰阴性杆菌中的一般发生率为6%~39%我国有哪些类别?与临床有什么关系和意义?1992年来世界各地报告了一类对头孢噻肟水解力强对头孢他啶水解力弱的能被克拉维酸抑制与TEM型和SHV型酶同源性很差,不到50%,而与产酸克雷伯菌的染色体酶同源性很高的ESBLs酶,被称为头孢噻肟酶,包括CTX-M和Toho系列的4组有20多种我国早期的几篇报告,用Etest或纸片协同方法发现我国的ESBLs和美国的不一样:北美用头孢他啶和头#744#2003122612ChinJLabMed,December2003,Vol26,No.12孢他啶/克拉维酸测出的ESBLs阳性率高于头孢噻肟组,而我国正相反,暗示亚洲的ESBLs亚型不同于北美与此同时2000年,英国Hawkey博士来华讲学,提出广州的肠杆菌科菌产生的ESBLs为CTX-M和SHV型朱戌冬[6]对1株非TEM,非SHV型的肺炎克雷伯菌进行了PCR和DNA测序确定为CTX-M-11型在其20株产ESBLs肺炎克雷伯菌结合子中有13株(65%)含pI为818的,可被克拉维酸抑制的非TEM,非SHV型ESBLs酶,这一工作由同一实验室的王辉等[7],以及经佘丹阳刘又宁陆坚唐英春俞云松等出色的研究加以完善王辉等证明了27/162株产ESBLs菌中头孢噻肟耐药性远高于头孢他啶,27株中19株(7013%)在质粒上表达了CTX-M-3ESBLs(pIs,816或818)佘丹阳等[8],也确证北京42株阴沟肠杆菌中72%产AmpC酶,43%产CTX-M-3,1616%产SHV-12陆坚等[9]证明42株大肠埃希菌和克雷伯菌中78%产多种CTX-M,1716%产多种SHV俞云松[10]证明52株大肠埃希菌和克雷伯菌中9213%产多种CTX-M,1514%产多种SHV他们都未发现TEM型ESBLs台湾Yu等[11]于2002年报道肺炎克雷伯菌中有CTX-M-3和CTX-M-14我国出现大量头孢噻肟酶和北美出现大量TEM型酶,可能和两地区使用抗生素的不同相关,头孢噻肟和头孢他啶是3代头孢菌素中两类结构有明显不同的药,所以成为不同亚类的ESBLs的底物CTX-M酶能水解头孢噻肟头孢曲松头孢地尼头孢克肟头孢波肟等,但头孢他啶对它很稳定,其次是头孢吡肟,因此在我国不能用头孢他啶或头孢吡肟单独测ESBLs是否需要制定某种政策,在医院的暴发流行较严重的病房有条件地停止使用头孢噻肟和头孢曲松?将它们限制在门诊应用有可能降低CTX-M类酶缓解3~4代头孢菌素的耐药性压力1988年以来,世界各地报告质粒AmpC酶有22种,分布在大肠埃希菌克雷伯菌及其他的肠杆菌科菌中,在我国已有少量发现,这类酶大大损伤了3代头孢的活性三我国的呼吸道病原菌的耐药性在快速增长上呼吸道感染包括急/慢性细菌性鼻窦炎急/慢性细菌性扁桃体炎/咽炎急/慢性中耳炎;下呼吸道感染包括社区获得性肺炎慢性支气管炎急性发作慢性阻塞性肺病急性发作等其常见病原菌为肺炎链球菌流感嗜血杆菌卡他莫拉菌A群B溶血链球菌金黄色葡萄球菌等[12]1998年我们[13]发现北京地区青霉素不敏感的肺炎链球菌(PNSSP)仅为1413%,2000年北京广州沈阳成都四地PNSSP为1513%[14],而在2000年上海地区PNSSP为2815%[15],2001年北京上海广州西安地区的儿童中,PNSSP均超过40%(4213%~5510%)本调查也发现2002年度PNSSP为4614%(其中SP为2317%,PRSP为2217%)这些数据表明,与1998年相比,我国肺炎链球菌对青霉素的耐药性在上升[14]2003年7月,在韩国召开的第4届抗微生物制剂及耐药国际论坛(ISAAR)上,大量的数据显示,全球范围内,PNSSP发生率较高的国家和地区是越南(90%)斯里兰卡(85%)南韩(70%)中国香港(68%)西班牙(65%)南非(60%),而中国大陆上升至12位,PNSSP为45%,较3年前明显上升这一数据与本次调查的结果相似,它提醒我们应当密切注意今后我国PNSSP的发展趋势王辉等,监测了2002~2003年度口服抗生素对全国5个城市中分离的964株呼吸道病原菌,其中肺炎链球菌409株流感嗜血杆菌247株卡他莫拉菌127株A群B溶血链球菌55株及对苯唑西林敏感的金葡菌99株的体外活性,以明确耐药现状所有菌送北京和医院后再一次鉴定,并采用琼脂稀释法测定9种抗生素对这些菌株的最低抑菌浓度(MIC)结果是全国5地区,青霉素中介的肺炎链球菌(PISP)为2317%,青霉素耐药的(PRSP)为2217%PISP发生率从高到低依次为杭州(4411%)武汉(2612%)沈阳(2115%)上海(2018%)北京(1815%)此外,尚调查了北京两所幼儿园其携带率为1217%;而PRSP的排序则为北京幼儿园(3419%)上海(3119%)武汉(2719%)杭州(2211%)沈阳(1318%)北京(816%)青霉素敏感的肺炎链球菌(PSSP)对所有B内酰胺类都很敏感(敏感率9717%~100%);对于PISP,阿莫西林/克拉维酸,头孢曲松敏感性仍达99%~100%;头孢呋辛头孢丙烯头孢克洛的敏感性分别为64%,5912%及3317%对于PRSP,前两药的敏感性降至6218%~67%,后3种药为614%~02代头孢菌素与3代有极明显的差别各地肺炎链球菌对左氧氟沙星的敏感性都很高:PRSPPISPPSSP的敏感率分别为9819%8918%,9812%914%的流感嗜血杆菌和8714%的卡他莫拉菌产生B内酰胺酶,北京杭州沈阳和上海产酶率无明显#745#2003122612ChinJLabMed,December2003,Vol26,No.12差别,对阿莫西林/克拉维酸头孢克洛头孢丙烯头孢呋肟头孢曲松阿奇霉素左氧氟沙星的敏感率在9614%~100%之间肺炎链球菌和A群B溶血链球菌对阿奇霉素克林霉素的耐药率高达80%以上;MSSA对阿奇霉素耐药率为60%所有A群B溶血链球菌对青霉素敏感,所有MSSA对头孢菌素敏感,呼吸道病原菌特别是肺炎链球菌的耐药性在增加,值得关注的是我国临床已证明链球菌对大环内酯类的体外高耐药性,但疗效尚可四下呼吸道感染及肺炎的微生物学诊断亟待加强在细菌室的常规化验中其结果的可信度最小的要算呼吸道其1是该区的寄生菌和病原菌混在一起,其2是要找到感染呼吸道的苛养菌不太容易[16,17],下呼吸道感染及肺炎(CAP)在我国是常见病,每年的发生数不下数百万人但是其常见病原体始终没有定论,各家报告结果差异很大因此诊断主要依赖临床病史,体检,影像学,其次才是病原体的查找细菌室在下呼吸道感染及肺炎诊断方面的方法包括:(1)痰标本的直接镜检;(2)痰培养;(3)血培养;(4)抗原抗体的测定;(5)聚合酶链反应的核酸放大技术,但目前经审批的PCR试剂盒屈指可数1.标本的采取常常是上述诊断技术成功的关键:呼吸道分泌物及痰标本的革兰染色:临床意义较大的标本有胸水纤维支气管镜取液经支气管抽吸物经支气管针吸液肺穿刺经支气管肺穿刺意义较差的为痰标本,但其便于收集正确采取痰标本可以提高它的临床价值[18]简单地说,低倍镜(10@)下,每视野鳞状上皮细胞数低于10个,中性多核细胞数高于25个为好[19]每一个步骤及解释镜检结果都应该是有经验的技术人员操作,并统一解释标准取标本前应该在使用抗生素之前,或停用抗生素至少3个半衰期之后镜下见到的典型的肺炎链球菌样双球菌,几乎有完整形态的菌丝和孢子假菌丝,抗酸染色见到抗酸菌墨汁染色下的新型隐球菌,脑脊液等无菌液及血培养中的中任何微生物,具有直接诊断意义医生一般认为优势菌即具有临床意义,那么什么是优势菌?(1)在油浸镜下该菌在\10个视野中都出现[20]或(2)在油浸镜下该菌出现的频率\50%[21](3)还有人建议要具备以上两种条件方可判为优势菌[22]痰的革兰染色结果必须与另1~2种方法比较后来评估其价值如常规痰培养结果或血培养的结果10多篇文献报告的结果之间差异极大,痰的革兰染色的敏感性可由15%到100%,特异性可由11%到100%快速的革兰染色镜检信息结合每年药敏监测统计报告,常常可以帮助医生经验用药[23]2.血培养在CAP中的意义:虽然其阳性率较低,但特异性却很强CAP病人经常在发病过程中的某一段时间发生菌血症所以当体温高于38e,或寒栗初起,千万别忘记先取血做血培养,然后再使用抗生素CAP中血培养的阳性率一般才5%~15%,当病人患衣原体/支原体与细菌混合感染的CAP时,血培养只能发现细菌,这需要临床来判断,不可忽略非典型菌的存在由于有菌血症的CAP病人的死亡率高,故血培养还具有抢救病人的作用3.痰培养:所有影响痰革兰染色质量的因素也同样影响痰培养标本中细菌必须活存,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌离开人体CAP病灶后很易死亡,所以取得标本后,要尽快送到实验室候检培养成功的痰只占20%~79%(平均5