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第十二章程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡（PCD）细胞衰老第一节程序性细胞死亡（PCD）受到严格的基因调控、程序性的细胞死亡形式。对生物体的正常发育、自稳态平衡及多种病理过程具有重要的意义。本节内容将涉及：•动物细胞的程序性死亡•植物细胞与酵母细胞的程序性死亡（自学）细胞死亡的方式主要有三种：细胞凋亡（apoptosis）细胞坏死（necrosis）细胞自噬（autophagy）动物细胞的程序性死亡机体结构细胞增殖细胞分化细胞凋亡细胞信号转导染色体（DNA与蛋白质的相互作用）衰老细胞凋亡（Apoptosis）●细胞凋亡一词的来源：细胞凋亡一词，即apoptosis，源自希腊语，本意指树叶的脱落或花瓣的凋零。选用此词，是强调这一过程是一种自然的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。2002年，悉尼·布雷诺尔（英）、罗伯特·霍维茨（美）和约翰·苏尔斯顿（英），因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理学/医学奖。JohnE.SulstonH.RobertHorvitz•SydneyBrenner秀丽隐杆线虫C.elegans是研究PCD的理想材料咽卵巢肠阴门直肠肛门雌雄同体细胞数：体：1090–131=959(cells)生殖：2000雄性（0.05%）细胞数：体：1090(cells)生殖：1000幼虫细胞数（个）：体细胞：556原始生殖细胞：2秀丽隐杆线虫细胞凋亡情况1、细胞凋亡的概念：一种有序的或程序性的细胞死亡方式，使细胞接受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应。该过程具有典型的形态学和生化特征，凋亡细胞最后以凋亡小体的形式被吞噬消化。细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，也常被称为细胞程序性死亡（即PCD，programmedcelldeath)。一）细胞凋亡的概念及特征一、细胞凋亡2、细胞凋亡过程及特征最重要特征：细胞质膜保持完整，内含物不外泄，不引发机体炎症反应。需ATP供能凋亡小体形成细胞凋亡开始正常细胞凋亡小体被吞噬胸腺细胞凋亡过程形态变化正常凋亡凋亡细胞表面发泡，许多泡状或者芽状突起，逐渐分隔，形成单个凋亡小体。胸腺细胞凋亡过程形态变化正常凋亡可逆膨胀细胞皱缩不可逆膨胀解体破碎胞膜完整细胞坏死细胞凋亡3、细胞凋亡的生化特征（DNA梯状条带）1）细胞色素C诱导0h2）细胞色素C诱导1h3）细胞色素C诱导2h4）细胞色素C诱导3h5）细胞色素C诱导4h6）阴性对照7）Marker细胞色素C作用：促进细胞内特异性核酸酶内切酶活化。DNA降解成180-200bp片段或其整数倍片段4、诱导细胞凋亡的因子1）物理性因子：包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如：热激，冷激）等。2）化学及生物因子：包括活性氧基团和分子（超氧自由基，H2O2），DNA和蛋白质合成的抑制剂，正常生理因子（激素、细胞生长因子）的失调及凋亡因子（肿瘤坏死因子，TNF）、细胞毒素等。1、凋亡的生理学意义：1）生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态等2）免疫细胞分化：淋巴细胞的克隆选择3）防御作用：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞以及被病原体感染的细胞。二）细胞凋亡的生理意义1）蝌蚪尾巴的消失蝌蚪在变态过程中，尾部细胞发生凋亡2）脊椎动物的神经系统的发育凋亡的神经元神经元靶细胞靶细胞分泌的存活因子通过细胞凋亡使神经元的数目与靶细胞相匹配神经生长因子等3）发育过程中手和足的成形过程凋亡细胞被吞噬后形成趾间隔胎鼠趾的发育2、凋亡的病理学意义1）病原体侵染诱导凋亡—HIV抑制凋亡—Poxvirus（痘病毒）2）细胞凋亡不足肿瘤、自身免疫疾病；3）细胞凋亡过度神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍性贫血、骨组织坏死等。三）细胞凋亡的检测◆形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察◆DNA电泳：DNA片段呈现出梯状条带◆TUNEL测定法（DNA断裂的原位末端标记法）◆彗星电泳法（cometassay）凋亡细胞DNA降解片段电荷发生了变化，在电场泳动的速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案。◆流式细胞分析（凋亡细胞为亚二倍体）1、形态学观测1）台盼蓝染色:台盼蓝可为活细胞排斥，但可使死细胞着色。2）Giemsa染色：可观察染色质固缩，凋亡小体的形成等。3）透射和扫描电镜：可观察凋亡细胞核的形态、结构变化，如：染色体固缩，凋亡小体的形成等现象。2、DNALadder检测1）诱导细胞的凋亡2）收集凋亡的细胞，提取基因组DNA3）以2%的琼脂糖胶电泳分离DNA4）EB染色进行观察染色质DNA在核小体间被切割3、TUNEL测定法（标记DNA断裂缺口的3’-OH）基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化下，加上荧光或DIG标记的dUTP，可通过荧光显微镜/流式细胞仪或酶促显色进行检测。TUNEL测定法检测晶状体上皮细胞的凋亡情况4、DAPIStaining方法（与DNA结合的染料）四）细胞凋亡的分子机制线虫（C.elegans）的凋亡研究发现：ced3、ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因可阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3在哺乳类同源物是ICE（Interleukin-1β-convertingenzyme，白介素-1β转换酶），即Caspase1，可促进细胞凋亡。常见的细胞凋亡途径有两条：Caspase依赖性的细胞凋亡（外源、内源性）和不依赖于caspase的细胞凋亡途径，两个途径一般同时被激活。1、Caspase家族与凋亡1）Caspase家族简介Caspase的活性位点均包含半胱氨酸（Cysteine）残基，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，故称天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶（Cysteineasparticacicspecificprotease），即Caspase。Caspase自身以非活化的酶原Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。2）caspase超家族成员及功能（15种）执行者负责切割胞质及核内的结构和调节蛋白，产生凋亡对执行者前体进行切割，激活执行者白介素前体的活化，不直接参与凋亡信号的传递Caspase的分类及功能（共15种）ExecutioneroreffectorAutocatalyticinitiator炎症执行者起始者/引发者A、起始者：对执行者前体进行切割、激活包括：Caspase-2，8，9，10，11B、执行者：切割胞质及核内的结构和调节蛋白，产生效应包括：Caspase-3，6，7C、激活期：前期细胞应答死亡信号，起始Caspase活化D、执行期：后期执行Caspase活化，执行细胞死亡3）Caspase的分类：4）Caspase的激活阶段：3）Caspase的结构特征①起始者及执行者均以无活性的酶原形式存在；②N端均含一段前区域；④在大亚基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2个大亚基和2个小亚基组成的杂四聚体；Activeenzyme催化位点Caspase的级联效应Caspase的酶原活化4）Caspase的作用底物目前已知的Caspase作用底物约280种①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物（ICAD）CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶（具内切酶活性）ICADCADDNACaspaseCaspase的作用底物举例降解②核纤层（lamina）蛋白核纤层解体核纤层染色体③细胞骨架蛋白：导致细胞解体，形成凋亡小体④其他的caspases⑤灭活细胞凋亡的抑制物当细胞接受凋亡信号分子（FasL，TNF等）刺激后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内衔接蛋白（Adaptorprotein）结合，这些衔接蛋白又募集Procaspase聚集在受体部位，胞质内的Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。2、Caspase依赖的细胞凋亡途径分为死亡受体（Fas）起始的外源途径及线粒体起源的内源途径两条。1）死亡受体起始的外源途径（书上P450）下游caspases活化后，作用于底物，裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解Dnase结合蛋白，使Dnsae释放，降解DNA形成DNAladder，裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂重排（如：磷酯酰丝氨酸由脂双层内页→外页），便于吞噬细胞识别并吞噬。外源性死亡受体通路凋亡诱导因素死亡受体（Fas)配体（FasL)的表达、结合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD接头蛋白死亡诱导信号复合物接头蛋白DD：死亡结构域DED：死亡效应结构域CARD:caspase募集结构域8，102，9凋亡诱导因子细胞凋亡内源和外源信号途径Bcl-2家族执行者起始者起始者Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子接头蛋白2）Bcl-2家族与线粒体起源的内源性细胞凋亡Bcl-2（B-celllymphomagene2）是一种原癌基因，是线虫抗凋亡蛋白Ced9在哺乳类中的同源物，与线粒体相结合，能改变线粒体外膜通透性（释放凋亡因子CytC），抑制或促进细胞凋亡。Bcl-2家族成员的基因根据功能不同可分为两组：A、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等抑制凋亡；B、Bax、Bak、Bad、Noxa等促进凋亡。BCL-2家族部分成员Bax和Bak寡聚化，促进CytC释放，引发凋亡；Bcl-2、Bcl-xL与Bax/Bak形成异二聚体，阻止Bax和Bak寡聚化，从而抑制凋亡。Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡Bcl-2家族促凋亡因子Bid被活化后的Caspase8或其他刺激因素裂解成2个片段，其中含有BH3（Bcl-2homology）结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor）结合并活化Apaf-1，被活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起细胞凋亡。细胞内源信号激发细胞程序性死亡起始者执行者凋亡蛋白酶活化因子CytC被释放并与Apaf1结合凋亡诱导因素死亡受体/配体的表达、结合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisBid活化线粒体通路活化死亡受体通路与线粒体通路的联系Caspase-3活化二、细胞坏死（necrosis）P543细胞受到意外损伤，如极端的物理、化学因素或与严重的病理性刺激而发生的细胞被动死亡形式。细胞坏死时，细胞内含物释放到胞外，引起周围区域的炎症反应。炎症反应细胞坏死细胞凋亡性质病理性的群体细胞死亡生理性或病理性的单个细胞死亡诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生生化特点被动过程，无新蛋白合成，不耗能主动过程，有新蛋白合成耗能形态变化细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀，失去质膜完整性胞膜及细胞器相对完整，细胞皱缩，核固缩DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一DNA片状（“拖尾”）DNA片段化（180-200bp）电泳呈梯状条带炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整局部无炎症反应凋亡小体无有基因调控无有细胞凋亡与细胞坏死的特征比较第二节细胞衰老cellaging或cellsenescence一般含义是复制衰老，是指正常细胞经过有限次数的分裂增殖后，停止分裂，细胞形态和生理代谢发生显著改变的过程。涉及内容●Hayflick界限（HayflickLimitation）●细胞在体内条件下的衰老（自学）●衰老细胞结构的变化（自学）●细胞衰老的分子机制（自学）1、概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是H