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第七章青霉素生产工艺产物的介绍；菌种；培养基；培养基、设备的灭菌；种子的扩大培养、发酵反应的级数；发酵方式及发酵过程的工艺；产物的提纯。第一节概述☺发展简史；☺剂量单位；☺用途；☺不良反应；☺性质。一、青霉素的发展简史☺自1929年AlexanderFleming发现一种青霉的培养液具有抑制金黄色葡萄球菌及其他某些革兰氏阳性菌的生长能力，并将其命名为青霉素（Penicllin）。该菌经过鉴定定名为点青霉（Penicilliumnotatum）。☺1940年牛津大学H、W、Flory、E、B、China及其同事完成青霉素分离、精制与结构测定，并肯定疗效，旋即广泛应用，以后点青霉素改用产黄青霉代替，培养方法由摇瓶改为深层培养，逐渐发展为青霉素工业。我国解放后由上海第三制药厂首先试制青霉素成功。目前，生产青霉素的发酵罐体积已扩大到百吨以上，发酵液浓度已达到每毫升60000单位左右。☺1959年美国J、C、希亨和K、R、亨利一朗根从青霉素发酵液中分离出青霉素母核6APA并成功地合成了第一个半合成青霉素——苯氧乙基青霉素。从此开始了对青霉素结构的研究，用微生物合成和化学合成结合的方法生产很多各具特点的新型半合成青霉素，使青霉素类得到广泛应用。二、剂量单位☺除了以重量作为剂量单位外，更常用特定的效价单位。如一个青霉素效价单位为能在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量；☺在抗生素已能被制成纯净的化学物质时，就可用重量来表示单位，例如1mg青霉素钠盐相当于1667个单位。三、用途☺青霉素是一种杀菌力强，毒性小，应用广的抗生素。☺主要用于制疗对青霉素高度敏感的溶性链球菌，肺炎球菌，葡萄球菌引起的丹毒扁桃体炎，猩红热，产褥热等。主要对G+，G-球菌有强大的杀菌作用，但对G-杆菌，真菌及病毒无效。临床上用于治疗葡萄球菌传染症，如脑膜症、化脓症、骨髓症等，溶血性链球菌传染症，如腹膜炎、产褥热以及肺炎、淋病、炭疽等。青霉素中以G型和X型作用最强，G型对梅毒有效，对葡萄球菌的作用也比X型强，X型对淋病、腹膜炎及肺炎则比G型有效。四、青霉素的不良反应☺毒性反应：大剂量服用可引起腱反射增强、肌肉痉挛、抽搐、昏迷等神经系统反应。☺变态反应：变态反应在各种药物中居首位，表现为过敏性休克、溶血性贫血、间质性肾炎、哮喘等。☺电解质紊乱：大量注射青霉素钠或钾盐可导致严重的电解质紊乱。☺雅－赫氏反应：治疗梅毒时出现的症状。五、青霉素的性质☺青霉素为一元酸，可与金属离子化合成盐类，青霉素盐易溶于水，游离酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有机溶剂，稍溶于芳香族碳氢化合物，不溶于脂肪族碳氢化合物，医药上常用钾盐和钠盐。但二者的水溶液极不稳定,所以以干粉密封小瓶内保存,临用前配制溶液。☺青霉素游离酸或盐类的水溶液均不稳定，极易失去抗菌能力、不耐热，一般保存于冰箱中。单青霉素盐的结晶纯品可于温室保存数年。五、青霉素的性质☺分子式：☺青霉素G钠盐C16H17O4N2SNa分子量356.4☺青霉素G钾盐C16H17O4N2SK分子量372.5☺青霉素钠的性状白色结晶性粉末，无臭或微有特异性臭，有吸湿性，遇酸碱氧化剂青霉素酶易分解失效。水溶液不稳定，极易溶于水，易溶于乙醇，不溶于脂肪或液状石蜡。☺青霉素钾的性状白色结晶性粉末，无臭或微有特异性臭，有吸湿性，遇酸碱氧化剂和青霉素酶等均能使青霉素G失效。本品极易溶于水，易溶于乙醇，不溶于脂肪油或液体石蜡。第二节菌种☺主要是产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)和点青霉（P.notatum）。目前应用的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。☺为了提高产黄青霉的青霉素产量使用诱变剂如二环氧丁烷、甲黄酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、X射线等。青霉菌的特性☺青霉菌属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科。☺其主要特性：营养菌丝体具有隔膜，为埋伏型或部分埋伏型、部分气生型；气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出（一般不具足细胞），具隔膜，单独直立或作某种程度的集合乃至密集为一定的孢梗束。其顶端生有扫帚状的分枝结构，称为帚状枝。帚状枝由多次分枝系统构成（不包括分生孢子链），对称，最后一级分枝即为瓶梗，着生瓶梗的细胞是梗基，支持梗基的细胞是副枝，瓶梗上产生分生孢子并形成不分枝的莲。青霉菌的培养特征☺它们培养在斜面培养基上可以是丝线状、刺毛状、串珠状、疏展状、树枝状或假根状。生长在液体培养基内可以呈混浊、絮状、粘液状，形成菌膜，上层清晰而底部显沉淀状。穿刺培养在半固体培养基中可以沿接种线向四周蔓延或仅沿线生长，也可以上层生长的很好甚至连成一片，底部很少生长或底部生长的好，上层甚至不生长，利用这些培养特征可以作为他们识别纯培养是否污染的参考。青霉菌的纯化☺青霉菌容易变异或染菌，一般丝状菌的野生菌株多数为异核体。生产菌在不断传代过程中菌丝间接接触、吻合后易产生异核体，部分结合子、杂合二倍体及自然突变产生变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。因此，青霉素菌种选育前的出发菌株和新变种获得之后都要进行菌种纯化，可以使用划线分离法、稀释分离法、显微镜操纵器分离单孢子法和培养形成单菌落等方法纯化。青霉素产生菌生长发育的六个阶段☺I期：分生孢子发芽。孢子先膨胀，再形成小的芽管，此时原生质未分化，具有小空孢。☺II期：菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，在II期末有类脂肪小颗粒。☺III期：形成脂肪粒，积累贮藏物。原生质嗜碱性仍很强。☺Ⅳ期：脂肪粒减少，形成中小空孢。原生质嗜碱性弱.☺Ⅴ期：形成大空孢，其中含有一个或数个中性红染色的大颗粒，脂肪粒消失。☺Ⅵ期：细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞。青霉素产生菌生长发育的六个阶段☺其中I—Ⅳ期初称菌丝生长期。产生青霉素较少，而菌丝浓度增加很多。III期适用于作发酵用种子。Ⅴ—Ⅵ期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势渐减弱，大量产生青霉素。Ⅵ期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。菌种保藏☺生产菌种一般保藏在沙土管或冷冻干燥管内。由沙土孢子接入母瓶斜面上，经过25℃培养6-7天，长成绿色孢子，制成孢子悬浮液，接入装有大米的茄子瓶内，经25℃相对湿度45-50%，培养6-7天制成大米孢子真空干燥，保存备用。生产时按一定接种量移入种子罐内，25℃培养40-45h，菌丝浓度达40%（体积/体积）以上，无杂菌即可以30%接种量移入发酵罐发酵生产青霉素。第三节培养基☺碳源：葡萄糖，乳糖，蔗糖，果糖，麦芽糖等。目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。☺氮源：可选用玉米浆，精制棉籽饼粉或麸粉，并补加机无氮源。☺前体：苯乙酸、苯乙酰胺，和苯氧乙酸常作前体，在发酵中加入。由于它们对青霉菌有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，采用多次加入方式。☺无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。第三节培养基☺典型的生长或种子培养基都含有有机氮源（如玉米浆），可发酵糖（如2%（w/v）的蔗糖或葡萄糖），0.5—1.0%（w/v）的碳酸钙用作缓冲剂；而其它无机盐类可能是满足生长所需要的。标准的接种液浓度为每升含20g干细胞，接种量为发酵液的10%（v/v）。某厂青霉素钾的培养基配方（一）☺1、碳源：乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液，糖蜜等，碳源的作用是维持菌体生长所需的能量，同时又是平衡发酵液pH值的基础物质。在碳源中以乳糖最适宜，但因为货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。但当葡萄糖浓度超过一定限度时，它会阻止氨酸V进入青霉素分子。因此发酵时要严格控制加糖，可以采用陆续加糖的办法；另一方面，糖浓度超过一定量时则菌体量相应增加，溶解氧转换受到影响。某厂青霉素钾的培养基配方（二）☺2、氮源：氮源的作用是供应菌体合成氨基酸和三肽原料，以进一步合成青霉素。玉米将是较为理想的氮源，含固体量少，有利于通风及氧的传递，因而利用率高，固体有机氮源还可提供一部分有机磷，供菌体生长，无机氮如硝酸盐、尿素，硫酸铵等可适量使用。某厂青霉素钾的培养基配方（三）☺3、无机盐及金属离子：碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值。磷一般采用磷酸二氢钾。加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需要的硫。由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子很多，已经证实铁离子在50ug/ml以上便会影响青霉素的合成，有人建议采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实际并无改进。所以青霉素的发酵罐还是以采用不锈钢制为宜，其他金属如：铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反应。某厂青霉素钾的培养基配方（四）☺4、添加前体：苯乙酰胺、苯乙酸和苯氧乙酸常用做前体。苯乙酸钠的理论需要量是每克青霉素需0.47g，而苯氧乙酸钠为每克青霉素v需0.5g。通常，发酵液中苯乙酸浓度控制在0.1%，苯乙酰胺控制在0.05-0.08%为宜。☺苯乙酰胺碱性下抑制菌体生长；苯乙酸在酸性（pH5.5）下毒性较大；中性条件下，苯乙酰胺毒性大于苯乙酸。☺有些前体物质能被菌体氧化，为减少氧化从用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法加前体。第四节培养基灭菌和空气除菌☺培养基用蒸汽实罐灭菌，发酵罐装料后，从所有与罐连接的管道中通蒸汽，然后保温半小时，一个发酵罐能有多处通蒸气的管道，例如：泡敌管；排气管（平时开，冲视镜时关）；二级进料管；补料管；通空气的管道；取样管等。空气除菌流程空气冷却器（排管形式的）旋风分离器（除尘和水汽）加热（50℃）总过滤（2并2串）纸过滤器（预过滤和精过滤）目的：除尘、水、菌；过程：第五节发酵工艺☺一、发酵工艺流程；☺二、工艺过程概要；☺三、发酵培养控制；☺四、发酵过程中的取样频次和项目一、发酵工艺流程冷冻管斜面母瓶孢子培养25℃，6－7d大米孢子孢子培养25℃，6－7d一级种子罐种子培养25℃，40－45h,1:2VVM二级种子罐种子培养25℃，13－15h,1:1.5VVM发酵罐发酵22－26℃，6－7d,1:1.5VVM放罐冷至15℃提炼二、工艺过程概要☺将产黄青霉素的孢子接种到含培养基的三角瓶中培养，然后进一步在固体培养基上扩大培养。将孢子接入种子罐后再进行逐级扩大培养(扩大培养级数通常为二级)。最后接入发酵罐中，主发酵需6—7天。☺标准的接种液浓度为每升含20g干细胞，接种量为发酵液的10%（v/v）。工艺过程概要☺将产黄青素霉的孢子接种到含100ml培养基的500ml三角瓶中，振幅2min，250r/min的旋转床上，25摄氏度培养4天，再转接到2L培养基中。此二级种子培养2天后再转接到装500L培养基的800L不锈钢罐中，主发酵需5-6天☺发酵pH值在6.5左右，温度23-28摄氏度培养液体积都在40000-200000L。通气速率为0.5-1.0vvm，容积氧吸收速率为0.4-0.8mmol/（L.min）。需用涡轮搅拌器强烈搅拌。包括通气在内的输入功率约为1-4W/L。☺最大理论产量为每克糖（以葡萄糖计）产0.12克青霉素。实际产量为糖耗量的3-5％。种子制备☺种子培养：将保藏的处于休眠状态的孢子通过严格的无菌手续，接种到经过灭菌的固体斜面培养基上，在25℃—30℃下培养6—7天，再用扁瓶在固体培养基（玉米粒或麸皮）上扩大培养。然后将孢子接入种子罐进行二级扩大培养。在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。从一级种子罐接入二级种子罐的接种量一般为5%—20%，培养温度一般为25℃—30℃。三、发酵培养控制☺温度的影响及控制；☺pH的影响及控制；☺通气与搅拌的影响及控制；☺铁离子的影响及控制；☺补糖的控制；☺补氮的控制；☺泡沫与消泡。温度的影响及控制☺青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度为20℃左右，故采用分段变温控制法。☺如延长稳定期从26度逐渐降至22度的发酵温度，可延长菌丝衰老。增加培养液的溶解氧浓度，延长发酵周期，有利于发酵后期青霉素单位的增长，减少发酵液中青霉素的降解破坏、提高产量.☺Constantinides等人对青霉素的分批发酵进行研究，得出的实验数据为：0～56h