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分子克隆技术:指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。化学本质：DNA1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件。基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S亚基中的16SrRNA3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程重组子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体，获得所需目的重组子的过程选择：转化子的初步筛选：通过某种外加压力（如：抗生素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。筛选：进一步检测目的重组子：通过某种特定的方法，从受体细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。启动子：DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列SD序列：核糖体结合位点终止子：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程重组子：含有重组DNA分子的转化子转化子：导入外源DNA分子后稳定存在的受体细胞供体、受体、载体是DNA重组技术的三大基本元件DNA体外重组的基本步骤1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记的载体分子上。3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。基因工程的基本操作步骤：1.目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2.重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记。3.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物载体应具备的条件：1.具有对受体细胞的可转移2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记。限制性内切酶的命名原则前3个字母代表来源的生物,随后1个字母或阿拉伯数字代表菌株,最后1个罗马字母代表发现或鉴定的次序staractivity高浓度的酶（100U/g）、高浓度的甘油（5%）、低离子强度（25mM）、极端pH值(pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的staractivity现象.抑制staractivity的措施①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度②保证反应体系中无有机溶济或乙醇③提高离子强度到100～150mM④降低反应pH至pH7.0⑤使用Mg2+作为二价阳离子DNA连接酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。体外连接DNA片段的方式黏性末端同种内切酶产生的黏性末端的连接，同尾酶产生的黏性末端的连接，不同黏性末端的连接。平末端的直接连接，末端修饰后的连接，加上连杆（linker），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接，DNA接头(adapter)连接法。平末端DNA片段的连接（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。载体应具备的条件1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.具有多种单一的酶切位点4.具有合适的选择性标记自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来5.分子量尽可能小，以提高其载装能力质粒DNA的复制类型严谨型质粒松弛型质粒天然质粒的缺陷（1）分子量大，拷贝数低（2）筛选标志不理想构建质粒克隆载体的基本策略1能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。2含多克隆位点3含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等4DNA分子尽可能小和较高的拷贝数。5根据特殊需要，组装各种“元件”，构建不同用途的质粒克隆载体。质粒克隆载体的构建1选择合适的出发质粒2正确获得构建质粒克隆载体的元件3组装合适的选择标记基因4选用合适的启动子5构建过程力求简单DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。蓝白斑筛选Ampicillin抗性和lacZ-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝Ti质粒介导转化的过程①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着②根癌农杆菌对植物信号物质的感受③根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化④vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生⑤T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中TA克隆的优点不需使用含限制酶序列的引物，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。TA克隆注意事项1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。真核生物的启动子：真核生物有三种类型的RNA聚合酶，每一种都有对应的启动子。1.RNA聚合酶I只转录rRNA，故只有一种启动子。2.RNA聚合酶II转录mRNA，其启动子最为复杂；3.RNA聚合酶III转录tRNA和5SrRNA，其启动子大都是位于转录的DNA序列之内，称为下游启动子。目的基因的获得:直接分离法;PCR扩增;构建基因组文库法;构建cDNA文库法;化学合成法直接分离法:限制酶酶切法(DNA分子已测序/目的基因已定位)基因组文库的构建(DNA未测序或未定位)：采用限制酶切割构建基因组文库筛选目的基因克隆基因文库构建的一般步骤：（1）染色体DNA大片段的制备①酶切法②物理切割法（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接②人工接头法（3）转导受体（4）筛选重组子cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。cDNA文库的特点优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文库小的多，容易构建缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及与核糖体识别的序列构建cDNA文库的一般步骤：（1）总RNA（totalRNA）提取（2）mRNA的分离纯化①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。②mRNA的分离纯化Column（柱）（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成②降解mRNA模板③cDNA第二链合成（cDNA第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。）（4）cDNA与载体连接：（5）噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖）基因的化学合成：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成目的基因的分离：目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法基因克隆的方法：一、目的基因的功能克隆二、序列克隆法三、差别杂交法四、减法杂交技术五、mRNA差别显示技术功能克隆：根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或基因组文库中调取目的基因表型克隆：如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）等无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆目的基因的功能克隆：在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因1、根据特异蛋白分离目的基因分离、纯化目的蛋白测定特异的氨基酸顺序推测编码该蛋白的核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸探针从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因分离、纯化目的蛋白目的蛋白免疫动物，制备抗体从cDNA表达文库中筛选目的基因根据特异蛋白分离目的基因局限性：特异蛋白已鉴定并分离纯化某些基因产物，难以分离纯化非所有基因有蛋白质产物遗传密码的简并性2、功能互补法克隆基因：利用被克隆的外源片段与宿主细胞染色体DNA具有功能互补。筛选营养缺陷型互补基因序列克隆法：根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因；采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离差别杂交法：组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因；受生长因子调节的基因；经特殊处理诱导表达的基因应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。基本过程：制备两种细胞群体的的mRNA提取物；以两种总mRNA或cDNA为探针；以表达目的基因的