第五章 微生物传感器

1第五章微生物传感器Microbiologicalsensor微生物传感器是生物传感器的重要分支。1975年，Divies制成了第一支微生物传感器;1977年，研制出检测精氨酸的微生物电极；1979年，研制出检测谷氨酰胺的组织传感器。2微生物传感器的优点：●微生物中含有多种酶，对于需要多种酶的反应，微生物传感器提供了方便；●稳定性好，使用寿命长；●响应迟钝时，放入培养基使活性恢复；●有些酶至今无法分离，可用含有该酶的细菌组成传感器；●克服酶价格昂贵、提取困难以及不稳定的缺点。3微生物传感器的缺点：由于含有多种酶，使选择性和灵敏度受到限制；底物需要通过细胞壁扩散，响应时间长。45.1微生物的特征一、微生物的营养要素水、碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐。5微生物要进行各种代谢以维持生命活动，就必须从周围环境中吸收适当的物质，这些物质称为营养物质。营养物质是微生物新陈代谢和一切生命活动的物质基础。根据微生物所利用碳源、能源的不同，可分为四种基本营养类型：光能自养型光能异养型化能自养型化能异养型二、微生物的营养类型1．光能自养型（光能无机营养型）以CO2为主要碳源，以无机物（如H2、H2S、H2O等）作为供氢体，通过光合作用获取生长所需的能量。光能自养微生物借细菌叶绿素的光合作用吸收日光的能量。念珠蓝细菌光菌绿素2H2S+CO2(CH2O)+H2O+2S（绿硫细菌和紫硫细菌）光叶绿素H2O＋CO2(CH2O)+O2↑（蓝细菌）以有机碳化合物作为碳源和供氢体，以光为能源进行光合作用而生长繁殖的微生物。2．光能异养型（光能有机营养型）光能细菌叶绿CH3CO2+2CHOHCH2O+2CH3COCH3+H2OCH3(红螺菌)3.化能自养型（化能无机营养型）以CO2作为主要碳源，利用无机化合物（如铵、亚硝酸盐、硫化氢、铁离子等）氧化时释放的能量作为能源进行生长的一类微生物。产甲烷细菌11化能自养微生物不含细菌叶绿素，不能利用日光的能量，但可在无机物的培养基中生长。不同的化能自养微生物在氧化各自所需的无机物时获得能量。如：硫化细菌硝化细菌产甲烷菌H2H2SSH2SO4NH3HNO2HNO34.化能异养型（化能有机营养型）以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中产生的能量作为能源而生长的一类微生物。大多数微生物属于这种营养类型。分为：腐生菌：利用无生命的有机物(如动植物尸体和残体)作为营养物质。寄生菌：只能在活寄主体吸收营养物生活的。兼性寄生菌：既营寄生又营腐生生活的。(结核杆菌)小结：（1）微生物营养划分主要依据：碳源和能源。（2）营养划分具有相对性，如红螺菌。能源碳源光能自养光能CO2光能异养光能有机物化能自养无机物CO2化能异养有机物有机物1516根据微生物反应对氧的要求将微生物分为：需氧型微生物，如枯草杆菌、青霉菌、假单胞菌等厌氧型微生物，如丙酮丁醇梭菌、巴氏菌、破伤风菌等17二、微生物的生长与控制根据微生物的生长速率，可分为四个主要生长期：●停滞期●对数期●恒定期●衰亡期18三、微生物的代谢微生物从周围环境中摄取营养物质，并通过酶的作用，在体内进行一系列的生物分解和生物合成反应，以保持正常的生长和繁殖，这一过程称为微生物的代谢。包括分解代谢和合成代谢。191.微生物的分解代谢（异化作用）微生物从周围环境中吸取营养，通过一系列酶促作用进行分解，并释放能量称为分解代谢。把自己变成非己。包括：碳水化合物的分解脂肪和脂肪酸的分解蛋白质的分解202.微生物的合成代谢（同化作用）微生物把从周围环境中获取的营养物质变成自身的组成物质，并且储存能量。简单地说就是把非己变成自己。21合成代谢主要包括：氨基酸的合成、蛋白质的合成、核苷酸的合成、RNA的合成、DNA的合成。分解代谢和合成代谢是生物体内不可分割的两个方面，两个过程共同维持微生物的生命。225.2微生物敏感膜的制备技术微生物固定化的要求：●固定化过程的反应条件和所用化学试剂对活细胞无害；●固定化过程适宜在无菌条件下操作；●固定后的菌稳定性要好。23微生物固定化方法常用夹心法和包埋法。245.3微生物传感器的类型微生物传感器从工作原理上可分为两种类型:●呼吸机能型微生物传感器●代谢机能型微生物传感器25微生物传感器类型26呼吸机能型微生物传感器以需氧型微生物作为生物活性物质，它在与有机底物作用的同时，细胞的呼吸活性提高，耗氧量增大，通过电极测定呼吸活性变化而转变的扩散电流值从而间接测定有机物浓度。27呼吸机能型微生物传感器28代谢机能型微生物传感器以厌氧型微生物作为生物活性物质，它的原理是微生物分解有机物，产生各种代谢生成物，如NH3，CO2，有机酸，可用相应的离子选择性电极测得代谢物浓度，进而测定底物浓度。29代谢机能型微生物传感器30微生物传感器按照信号转换器的不同分为：●电化学微生物传感器●光微生物传感器●热敏电阻型微生物传感器●压电微生物传感器●燃料电池型微生物传感器等311.电化学微生物传感器■电流型微生物传感器微生物敏感膜与待测物发生反应后，通过输出电流信号的变化来检测某一物质含量的变化。常用的信号转换器件有氧电极、过氧化氢电极。（1）甲烷微生物传感器33甲烷与空气可以形成爆炸性混合物，空气中甲烷含量在5-14％之间具有爆炸性；另外，甲烷的生产过程是一个发酵过程，控制发酵过程也需要测定各发酵阶段的甲烷含量。34测量系统的组成原理：甲烷电极所用微生物是甲烷氧化细菌（鞭毛甲基单胞菌）。从天然物质中提取并在一定的培养环境中生长的甲烷氧化细菌，通过氧化甲烷而生长，甲烷是它的主要碳源和能源。35甲烷微生物传感器系统示意图361,10-真空泵；2-气体样品袋；3-气体管道；4-过滤膜；5-可控反应器；6-甲烷-微生物反应器；7-氧电极；8-放大器9-记录仪；11,12,13,14,15,16,17-玻璃阀甲烷微生物传感器连续检测系统37含甲烷的气体流过有微生物的反应池时，甲烷被微生物同化，微生物呼吸增强而消耗氧，使得反应器中溶解氧的浓度降低。当微生物的耗氧量与从样品向微生物扩散的氧量之间达到平衡时，电流下降会达到稳定，稳态电流的大小取决于甲烷的浓度。参比电极所在反应池中不含微生物，氧含量及电流不变，所以两电流之间的最大差值与气体中甲烷含量有关。原理38(2)致癌物微生物传感器利用枯草杆菌的DNA修复机构缺损菌株（）和野生菌株（）两种细菌，分别固定在两个氧电极上，并将两个氧电极的电信号输入差分电路，即构成检验致癌物质的传感器系统。Rec-Rec+39Rec+Rec-1-；2-；3-过滤器；4-聚四氟乙烯膜；5-铂阴极；6-铅阳极；7-记录仪；Ⅰ，Ⅱ-为含DNA修复机构缺损株和野生株的枯草杆菌测定变异原的微生物传感器系统40两个氧电极同时放入待测溶液中，若溶液中含有致癌物质，则内的DNA将受到损伤而死亡，氧电极由于停止呼吸而不再消耗氧，氧电流增加。但内的DNA虽受到短暂损伤却能自动进行修复，因此呼吸反应继续进行而不断消耗氧，使电流保持初始时的水平，差分电路显示出的电流差值表示被测物质是致癌可疑物质。Rec-Rec+原理41（3）BOD微生物传感器BOD（生化需氧量Biochemicaloxygendemand）的测定是监测水体被有机物污染状况的最常用指标。常规的BOD测定法操作复杂、重复性差、耗时耗力、干扰性大，不宜现场监测。BOD（生化需氧量）微生物传感器结构示意图BOD微生物传感器的电流响应44将传感器放在缓冲液中，微生物处于内源呼吸状态，当氧的扩散作用于内源呼吸的耗氧量达到平衡时，传感器输出恒定的电流。将传感器放在待测样品中，微生物由内源呼吸变为外源呼吸，耗氧量增大，扩散到氧电极的氧降低，输出电流降低，电流的下降值与有机物的浓度呈一定的线性关系。原理商业化BOD微生物传感器目前利用的微生物有假单胞菌、活性淤泥菌、丝孢酵母菌、枯草芽孢杆菌。46（4）甲醇和乙醇微生物传感器用固定化的甲醇细菌或丝孢菌母与氧电极组成。47甲醇（5）醋酸微生物传感器用固定化的丝孢菌母与氧电极组成。48醋酸（6）葡萄糖微生物传感器49用固定化的假单孢菌与氧电极组合而成。50（7）氨微生物传感器氨的测定在医疗、环境及工业领域的检验中都很重要。用氨气敏电极测定必须在强碱（pH11)条件下进行，有些挥发性化合物如胺会干扰测定。由固定化硝化菌、聚四氟乙烯透气膜和氧电极组成的微生物电极可用于氨的测定。51硝化菌(Nitrosomonas.sp)可利用氨作为唯一的能源，在反应中消耗氧，即2NH3+3O23HNO2+H2O氨的浓度可以通过检测附着在氧电极上的固定化微生物的呼吸量来测定。5253电位型微生物传感器电位型微生物传感器以电位型电极作为信号转换器，输出的信号是电位。常用的转换器件有：pH电极、氨气敏电极、二氧化碳电极等，各种电位型传感器的电位值与被测离子活度之间的关系符合能斯特方程。（1）谷氨酸微生物传感器是一种酸性氨基酸。在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。54谷氨酸谷氨酸钠大肠杆菌具有谷氨酸脱羧酶，与CO2电极组成微生物传感器测定谷氨酸的含量。55（2）尿素微生物传感器56用谷氨酸棒状杆菌作为酶源，可以制备尿素传感器。根据电极电位响应便可对尿素含量进行测定。57部分电位型微生物传感器582.光微生物传感器原理：有些微生物具有光合作用能力，在光照作用下能将待测物转变成电极敏感物质或其本身能释放氧，将这类微生物固定化并与氧电极、氢电极等结合即制得光微生物传感器。3.热敏电阻微生物传感器4.压电微生物传感器压电石英晶体谐振频率变化量与晶体表面均匀沉积的极薄层刚性物质质量之间成正比，即2200002//fKfmAfmA605.燃料电池型微生物传感器有机分子被氧化时能释放一定能量，称为“燃料”，使燃料的化学能转变为电能的原电池装置称为燃料电池。如果在电池中发生的反应由生物所催化，这种装置便称为生物燃料电池（bio-fuelcells）。61燃料电池型微生物传感器信号产生机理有机物作为燃料在阳极室中被微生物氧化，产生的电子传递给电池阳极，电子通过外电路到达阴极，从而形成回路产生电流。其阳极和阴极反应式如下所示：阳极反应：(CH2O)n＋nH2OnCO2＋4ne-＋4nH+阴极反应：4e-＋O2＋4H+2H2O(1)生物燃料电池的原理63部分燃料电池型微生物传感器(2)生物燃料电池的特点原料来源广泛；操作条件温和；资源利用率高，无污染。(3)生物燃料电池的应用前景作为新能源；改善汽车的燃料结构；为可植入人体的设备提供能量。66(1)酶—微生物混合型传感器敏感材料由酶和微生物混合构成，这样可使敏感膜的性能更加完善。6.其他类型微生物传感器22232(NH)CO+HO2NH+CO脲酶2NH3+3O23HNO2+H2O硝化菌222222+HOHOHOOHCHOHO肌酸酐水解酶脒基肌酸水解酶肌氨酸氧化酶肌酸酐肌酸肌酸肌氨酸脲肌氨酸甘氨酸69(2)嗜热菌传感器又称高温细菌、嗜热微生物。生活在高温环境中，如火山口、温泉、工厂高温废水排放区。70用嗜热菌作为敏感材料，可在较高温度下使用，同时具有抗酸、碱能力，可克服常温菌不耐酸、碱和高温的不足。717.生物组织传感器生物组织传感器是以活的动植物细胞切片作为分子识别元件与相应的信号转换元件构成生物组织传感器。72生物组织传感器的特点：●有丰富的酶，这些酶在适宜的自然环境中可得到相当稳定的酶活性；●在需要的酶难以提纯时，直接利用生物组织可以得到足够高的酶活性；●制作简便。73常见的生物组织酶传感器74谷氨酰胺+H2O谷氨酸+NH3（1）猪肾-谷氨酰胺电极谷氨酰胺水解酶75还可以测定葡萄糖-6-磷酸，肾组织中含有葡萄糖-6-磷酸脱氨异构酶，两种酶在不同的pH下活性不同。76尿素+H2OCO2+NH3（2）夹壳豆-尿素电极脲酶77（3）苹果-多巴胺电极当多巴胺风起云涌的时候，我们狂热地爱与被爱着，尽情享受爱的甜蜜；当多巴胺风平浪静的时候，我们坦然处