2-RNA的提取和鉴定

PresentationTitleGoesHere…presentationsubtitle.RNA的提取和鉴定::color,composition,andlayout一．背景知识核糖核酸(RiboNucleicAcid，简称RNA)是由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称RNA。::color,composition,andlayout中心法则（thecentraldogma)Reversetranscription::color,composition,andlayoutRNArRNAmRNAtRNA蛋白质合成模板核糖体体组成成分转运氨基酸::color,composition,andlayouthnRNAsnRNAsnoRNAscRNA不均一核RNA，成熟mRNA前体核内小RNA，参与hnRNA剪接、转运核仁小RNA，rRNA加工核修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分::color,composition,andlayoutRNA提取的目的：1)完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。2)临床诊断中的应用：病毒检测等::color,composition,andlayoutRNA提取的基本原理和步骤破碎细胞去除大分子杂质去除蛋白质、脂类、DNA等沉淀RNA同时去除盐类、有机溶剂进一步纯化RNA::color,composition,andlayoutRNA提取的基本原则总原则1.保证核酸一级结构的完整性2.尽量排除其他成分的污染::color,composition,andlayout•及时处理样本，或置液氮中保存•试验器皿及配置试剂用水用0.1%DEPC处理且高压消毒•尽可能早的去除组织与细胞内的蛋白质•联合使用RNase抑制剂•操作过程中，戴手套口罩，避免空气流通•进行完整性的检测如何尽量避免RNA的降解？::color,composition,andlayout技术路线/基本原理：RNA的释放RNA的分离、沉淀RNA的洗涤、纯化机械剪切力或变性剂75%乙醇洗涤、亲和层析柱纯化盐类+有机溶剂::color,composition,andlayoutRNA的提取目前阶段主要可采用两种途径：1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来该方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。2)在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相，而达到分离RNA的目的。::color,composition,andlayout根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下两种制备方法：1）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍2）LiCl/尿素法以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。::color,composition,andlayout本来Trizol是一个专利的品牌，最早是MRC实验室的科学家发明的方法，后来把专利卖给了Invitrogen/Gibco，Invitrogen/Gibco将此方法推广到世界,目前使用甚广。Trizol（异硫氰酸胍-苯酚法）::color,composition,andlayout由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的单相的快速抽提试剂可在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNATrizol可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。如果细胞量过少或组织来源特异，可以采用相应试剂盒提取RNA。Trizol（异硫氰酸胍-苯酚法）::color,composition,andlayout异硫氰酸，β-巯基乙醇，SDS裂解细胞酸性条件（pH4.0)下酚、氯仿抽提，离心，蛋白质，DNA和脂质进入有机相，而RNA存在于水相异丙醇沉淀水相中的RNATrizol法的原理可在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性::color,composition,andlayoutTrizol法提取RNA操作步骤1、剪碎的鼠肝中加入Trizol试剂，进行机械匀浆，取1mlTrizol匀浆液于1.5ml离心管内，室温放置5分钟，以充分裂解细胞。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。目的：变性剂充分作用裂解细胞，释放核酸。::color,composition,andlayout2、每管加入200ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min；注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。3、4℃12,000rpm离心15min。4、吸取上层水相，至另一离心管中。注：不要吸取中间界面。目的：分离RNA、DNA、蛋白质等。::color,composition,andlayout酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，为什么还要加入氯仿？::color,composition,andlayout酚有一定的水溶性，单独用酚抽提会有酚溶解到水相中，影响后续实验。氯仿是强有机溶剂，加速有机相与水相分层，去除核酸水溶液中残余的酚::color,composition,andlayout5、加入0.5ml异丙醇混匀，室温放置5-10min。6、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。目的：沉淀RNA异丙醇会夺取大量RNA分子间的水分子，因此RNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀::color,composition,andlayout7、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。（此时可放-70℃保存）目的：洗涤RNA，去除残余的盐类等杂质。::color,composition,andlayout9、短暂离心收集管壁液体并吸弃。室温晾干2-3min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。10、用200ul(体积可根据RNA的沉淀量具体调整)DEPC处理的H2O溶解RNA样品，溶解后立即置于冰上。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。8、4℃10000rpm离心5min，尽量弃上清。::color,composition,andlayout①剪碎的鼠肝中加入Trizol试剂，进行机械匀浆，取1mlTrizol匀浆液于1.5ml离心管内，室温放置5分钟，以充分裂解细胞。每管加入200ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min；②12,000g离心15min。③小心吸取上层水相，至另一灭菌、无RNase的离心管中；④加0.5ml异丙醇混匀，室温放置5-10min；⑤12,000g离心10min，弃上清，可见RNA沉于管底；⑥加1ml75%乙醇（DEPC处理的H2O配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀（此时可放-70℃保存）。⑨8,000g离心5min，尽量弃上清。⑩短暂离心收集管壁液体并吸弃。室温晾干2-3min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。11用200ul（体积可根据RNA的沉淀量具体调整）DEPC处理的H2O溶解RNA样品，溶解后立即置于冰上。12测定RNA的浓度、纯度及质量。安全！::color,composition,andlayout简易TBE电泳观察RNA的完整度1）制胶：琼脂糖凝胶粉（0.7%），消毒TBE缓冲液，Goldview显色剂2）上样：10ul样品（含上样缓冲液）混匀后，加入凝胶孔中；上样缓冲液（loadingBuffer):溴酚蓝、二甲苯青FF、蔗糖，甘油3）电泳：电泳110V，15min。4）紫外灯下观察200ulRNA溶液（冰上）10ulRNA+1.5ulloadingbuf.电泳观察2ulRNA测吸光度OD260/2805ulRNA用于RT反应（0.2mlPCR管）OD260/OD280值：1)取2ulRNA溶液用，（H2O(DEPC)作为空白对照），紫外分光光度计进行测定。2)RNA浓度(ug/ml)=OD260×40::color,composition,andlayout方法一、检测RNA溶液的吸光度260、320、230、280nm的吸光度分别代表核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质的水平•纯的RNA，230：260：280＝1：2：1•一般OD260/OD280=1.8~2时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的•当R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显•当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了•RNA浓度=OD260×40μg/ml×稀释倍数RNA质量及纯度的分析::color,composition,andlayout方法二、RNA的电泳图谱•检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量好。方法三、保温试验•RNA溶液在70℃的恒温水浴中保温1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。比较两者的电泳条带，说明RNase的污染情况RNA质量及纯度的分析::color,composition,andlayoutSXD真核细胞总RNA电泳结果：5S+5.8S28S实验结果与分析::color,composition,andlayout