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细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法(1)HE(苏木精—伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。(2)丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。(3)台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。(4)透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。2、DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物,测光吸收制。用途该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。3、流式细胞仪定量分析细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。应用价值流式细胞仪检测具有以下特点:1)、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期(1)检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。(2)DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3•的羟基(-OH)端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有二种:1、原位缺口转移(insitunick-translation,ISNT)技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3•-OH端2、原位缺口末端标记技术(insituendlabellingtechnique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL更为合适。(3)检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(AnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力。因此,AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。结果判断:正常活细胞AnnexinV、PI均低染;凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染;坏死细胞AnnexinV/PI均高染。应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此,AnnexinV联合PI法更加省时,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。方法及步骤A.直接标记抗体(FITC标记抗体):(1)收集1×106个细胞,800rpm离心5min,4℃以上冷PBS洗一次。(2)用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟,800rpm离心5min去上清。加2mlPBS重悬洗涤细胞,800rpm离心5min。(3)用1ml含5%人血清的PBS重悬细胞,冰上孵育10min,800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS,避光冰上放置30min,离心弃上清。加入200ul1%多聚甲醛固定,待测即可。(4)用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。B.未标记抗体间接免疫荧光标记法:(1)收集2×106个细胞,用冷的PBS2ml洗涤细胞一次,800rpm离心5min。(2)用2ml4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min;2mlPBS重悬细胞,800rpm离心5min;(3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞,冰上放置10min,800rpm离心5min。(4)加入饱和剂量未标记抗体,冰上放置40min,800rpm离心5min,用2ml冷的PBS重悬细胞,800rpm离心5min,洗去未结合一抗,重复一次。(5)加入荧光标记(FITC)标记的二抗,冰上避光放置40min后,800rpm离心5min,去上清,PBS洗涤两次。(6)加入0.5ml1%多聚甲醛重悬细胞;固定待测。(7)流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品(PI染色)的制备:(1)待测样本制成单细胞悬液,然后200g离心5分钟,弃上清。(2)用4℃预冷的70%冷乙醇固定,4℃保存,至少固定18小时。(3)调整细胞浓度为106细胞/毫升,取1毫升细胞悬液,用PBS洗三次,细胞重悬于1毫升PI染液中,37℃孵育30分钟即可进行流式分析。(4)PI染液终浓度为50微克/毫升,RNaseA终浓度为20微克/毫升。培养细胞染色体显示法(1)传代培养细胞染色体显示法培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗处理—预固定—固定—重复固定—制片—染色和封片1.培养细胞:取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%~90%汇合单层培养细胞。 2.加秋水仙素:使用最终浓度为0.02~0.8微克/毫升营养液,温箱继续培养6~10小时;或用低温封闭法:把培养细胞置于4℃条件下6~12小时后,再于37℃温箱继续培养6~10小时处理(加秋水仙素)。 3.采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养瓶,左右反复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落,注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响观察。 4.离心:收集培养液,1000转/分钟离心5~10分钟。 5.低渗处理:吸除上清液、加入预温至37℃的0.075MKCl溶液,在温箱中静置20~30分钟。 6.预固定:向悬液中加新鲜1:3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打调匀,此措施能起到先使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块。 7.固定:离心,同4,吸除上清液,加新鲜固定剂5~10ml;加固定剂时要用一手微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹打均匀,置15~20分钟。 8.重复7,末次离心后,小心吸除大部分上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液0.5~1ml。 9.制片:用滴片法制片,按如下步骤:彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片,在载物片表面出现细微水气时,立即向片的一侧滴2~3滴细胞悬液,滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。 10.染色和封片:一般常用Giemsa染色:取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合,染色10分钟后,水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片后,再过二甲苯,然后封片亦可。 (2)人末梢血微量全血培养染色体显示法 1.培养液准备:取15ml培养瓶数个,每瓶内分别充入5ml培养液(pH7.2),内含:1640培养液(含10%~15%小牛血清),PHA0.1ml,青霉素100单位和链霉素100微克/毫升培养液 2.抽血针管准备:取2~5ml针管一支,在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器,无菌抽肝素(100U/mlBBS)少许湿润针管,如动作迅速不用肝素亦可。 3.采血:用棉签75%酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次,缚止血带,静脉取血1~2ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4~0.5ml,如系外出采血,安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作,但动作要迅速,以减少污染;在采血量不多或不应抽血的情况下,亦可在耳垂、手指肚(无名指)用刺血针采血。 4.培养和加秋水仙素:37℃温箱中培养到60~72小时之间,此时细胞分裂相最多,向每培养瓶内加秋水仙素,最终浓度0.02~0.08微克/毫升营养液,再培养4~6小时。 5.低渗:1000转/分钟离心10分钟,吸除上清液,加入预温过的0.075MKCl溶液10ml,置温箱中低渗处理15~20分钟。 6.其余步骤与处理传代细胞法相同。 (3)羊水细胞培养 1.抽取羊水:无菌抽取羊水10-20ml,立即注入无菌离心管 2.离心分离:1000转/分离心10分钟,弃去上清,留0.5ml. 3.培养:加培养液4ml(含小牛血清1ml),用NaHCO3调PH至6.8,置37度培养,在温箱培养7-10天,可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长;加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液,作用10-12小时。 4.其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同。 一般染色体制片程序 1、取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。 2、将培养基换成10mlDMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基,处理1~2小时。 3、将细胞培养液倒掉,马上加入3~4ml0.1%胰蛋白酶,并立即摇晃0.5~1min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后,马上加入终止液终止消化,并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中,并在1200r/min离心4min。 4、将上清液倒掉,剩余50ul左右的液在管中,并轻微震动,使细胞沉淀重新悬浮。 5、加入10ml的低渗液(0.075MKCL),第一毫升要逐滴加入,并边加边摇晃。 6、37℃水浴中低渗30min。 7、再加入1ml冰冷的固定液(甲醇:乙酸=3:1的混合液),并马上摇匀,离心,1000r/min、10min。 8、同步骤4。 9、加入10ml冰冷的固定液,第一毫升要逐滴加入,边加边摇晃。 10、室温下固定30min,然后离心,1000r/min、10min。 11、同步骤4。 12、加入10ml冰
本文标题:细胞凋亡的几种检测方法
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