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引物延伸【方法】（一）用放射性γ-32P-ATP标记引物用放射性γ-32P-ATP标记引物T4PNK（1单位每微升）3µlPNK10×buffer2.5µl引物(10µM)1µl(10µM)γ-32P-ATP3µlH2O15.5µl总体积25µl37°C30min;70°C5min。反应完成后-20°C冻存。(三)引物延伸反应1.RNA处理将从-60℃,冰箱中取出的75%乙醇保存的RNA离心,4°C,12000rpm,10-20min,倒掉上清。吸干残液.用无核酸酶水溶解，并测浓度和纯度。2.分别在每管200µlPCR管中加入：AMV2×BUF5µl标记引物1µlRNA5µl50℃(因引物Tm值决定)30min；25℃10min5.在25℃10min时候，配制下述混合液：另取1个无RNA酶的EP管，加入：进行的反应数1个反应6个反应9个反应无核酸酶水1.6µl10µl15µlAMV2×BUF5µl30µl45µl焦磷酸钠1.4µl9µl13µlAMVRT1µl6µl9µl总计9µl55µl82µl6.快速加入4步骤中的PCR管中，每管加9µl。42℃反应40min7.浓缩至8µl（大约20min），直接加入2µlLoadingDye8.90℃加热10min，上样。9.6%变性聚病烯酰胺凝胶,电泳,1800V,2h左右。10.X光片压片,放射自显影.（二）测序反应1.反应体系测序反应的模板(5ng/µl)2µlTaq酶10×buffer2.5µl用γ-32P-ATP标记的引物1.5µlDNA聚合酶（测序盒）1µlH2O10µl总体积17µl2.GATC测序反应混匀后,分到4个PCR管中，每管为4µl.每管各加入ddGTP/ddATP/ddTTP/ddCTP,2µl之后PCR若引物G+C低于50%则:95℃2min,95℃30s,42℃30s,70℃1min,30个循环,4℃之后加3µlStopSoluting..若G+C高于50%，则95℃2min,95℃30s70℃1min,30个循环,4℃之后加3µlStopSoluting.反映完成后保存至-20℃冰箱。注:1.实验过程中既要做好自我防护，也要注意同位素对周围环境的污染。所有同位素操作用的实验器材禁止带出实验室。2.实验时戴手套，口罩，手套要勤换，防止RNA的降解。整个实验过程中要做到无RNA酶污染。实验所用移液枪，PCR管都要做到无RNA酶，并定期要用Ambion公司的RanseZap处理。3.RNA的稀释。RNA稀释后浓度最好在2000ng/µl-3500ng/µl,浓度太低不易做出结果，浓度太高仪器测不准。4.StopSoluting可以在抽干之前加入，也可以在抽干之后加入。抽干时，机器预热后，抽干17min,若没有预热，抽干22min。5.如果要同时做野生株和突变株，要调整上样量一致，测完浓度后，加入相对体积（等量）的稀释好的RNA，不足5µl的补足水，保证每个管里都是10µl.6.洗胶板。胶板表面要洗干净，用洗涤灵洗后用清水冲洗干净，晾干。凹面板要涂擦硅油（以利于揭胶），多余的硅油用95%的酒精冲掉。7.粘胶板，避免胶板边缘产生缝隙漏胶。胶板底部要特别注意，容易漏胶。8.6%变性聚病烯酰胺凝胶的配制。聚病烯酰胺有毒，操作过程中，要避免液体沾到皮肤上。50ml的胶量加入300µl的10%过硫酸铵，30µl的TEMED,混匀，灌胶。灌胶时不要产生气泡。9.电泳。电泳前样品变性。90℃加热10min，变性完成后立即将样品放在冰盒上。预电泳10-30min.上样前，胶孔要吹，以去除多余的尿素。先上引物延伸反应样品，再上测序反应样品。测序反应上样前将胶孔再吹一遍。10.电泳完成后揭胶时要小心，避免将胶弄碎。先揭开凹面板，用裁好的滤纸覆盖到胶上，将其揭下来，然后用保鲜膜包裹，放入显影夹，在暗室中放入胶片，-60℃过夜后显影。11.洗片子时胶片要完全浸泡到显影液和定影液中。定影后，再用清水将胶片冲洗干净。