电镜与无机荧光探针在生物研究中的应用

电镜与无机荧光探针在生物研究中的应用何飏（中国药科大学海洋药学专业09444班26号）摘要电子显微镜和无机纳米粒子在生物医学领域中做出了巨大的贡献,并不断开辟生物研究的新领域,主要从细胞亚细胞的形态结构上阐明疾病的发生、发展及转归规律,丰富了传统病理学的知识。通过对亚细胞结构和病原体的观察,可以诊断一些肿瘤疾病、心血管疾病、肝病、肾病、血液疾病、细菌、病毒、寄生虫疾病等。随着电镜技术的不断改进以及与多种研究手段相结合,电子显微镜将在生物医学领域应用会更加广泛。对于无机纳米粒子探针，本文在生物分析领域的研究进展,分别从生物分子与纳米粒子的耦联方式、检测生物分子的纳米金探针、核酸或蛋白质修饰的其它纳米探针以及生物纳米技术的应用前景4个方面对该领域的发展进行了概述.关键词电子显微镜无机纳米粒子探针生物研究应用Theapplicationofelectronmicroscope,inorganicfluorescentprobeinbiologicalresearchAbstractTheelectronmicroscopeandinorganicnanometerparticleshavemadegreatcontributionsinthefieldofbiomedical,andconstantlyopenupanewfieldofbiologicalresearch,mainlyillustratingthemethodsofgeneration,developmentandtransformationofdiseasesfromcellsandtheshapeofthecellsinthestructure,whichenrichthetraditionalpathologyofknowledge.Throughobservationofthecellularstructureandpathogens,wecandiagnosesometumordisease,cardiovasculardisease,liverdisease,kidneydisease,blooddisease,bacteria,viruses,parasitediseases,etc.Withthecontinuousimprovementofelectronmicroscope(tem)andcombinationbetweenelectronicmicroscopeandawidevarietyofresearchmethod,electronmicroscopewillbemorewidelyappliedinbiomedicalfield.Forinorganicnanometerparticleprobe,thedevelopmentofthisfieldwillbesummarizedfromrespectiveanalysisofthebiologicalmoleculesandnanoparticlescouplingway,thedetectionofbiologicalmoleculesnanometergoldprobe,othernanoprobemodifiedbynucleicacidorproteinandbiologicalnanometertechnologyapplicationprospectintheresearchprogressofbiologicalfieldKeywordsElectronmicroscopeinorganicnanoparticleprobebiologicalresearch1、电子显微镜电子显微镜包括扫描电子显微镜和透射电子显微镜两种类型,利用透射电子显微镜可以观察样品内部超微结构,利用扫描电子显微镜可以观察样品表面形貌,立体感强,在生物领域应用较多的是透射电子显微镜。透射电子显微镜的发明为人类在生物医学科学研究领域做出了巨大的贡献,早在20世纪40年代电子显微镜就在生物医学上开始发挥其作用,在病毒学、细胞生物学、组织学、病理学、分子生物学及分子病理学都有应用[1-2]。1.1电子显微镜技术在医学领域应用特点随着科学技术的发展,电子显微镜放大倍数已从第一台电镜的十几倍提高到现在的百万倍,因此在生物医学领域利用高性能的电子显微镜观察细胞中各种细胞器正常的和病理的超微结构,诸如内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体、细胞骨架系统等,对探明病因和治疗疾病有很大帮助。通过研究细胞结构和功能的关系,也可以研究细胞的通讯与运输、分裂与分化、增殖与调控等生命活动的规律,电子显微镜也可结合各种制样技术观察病毒、细菌、支原体、生物大分子等的超微结构,是现代生物医学研究不可替代的工具。1.2电子显微镜技术在肿瘤诊断中的应用电子显微镜技术的应用是建立在光学显微镜的基础之上的,光学显微镜的分辨率为0.2m,透射电子显微镜的分辨率为0.2nm,也就是说透射电子显微镜在光学显微镜的基础上放大了1000倍。因此,透射电子显微镜突破了光学显微镜分辨率低的限检查才能作出准确诊断。制,成为了诊断疑难肿瘤的一种新的工具。有研究报道,无色素性肿瘤、嗜酸细胞瘤、肌原性肿瘤、软组织腺泡状肉瘤及神经内分泌肿瘤这些在光镜很难明确，但利用电镜可以明确诊断。[3-5]1.3电子显微镜技术在肿瘤鉴别诊断中的应用透射电子显微镜观察的是组织细胞、生物大分子、病毒、细菌等结构,能够观察到不同病的病理结构,也可以鉴别一些肿瘤疾病,有研究报道电子显微镜技术通过超微结构观察可以区分癌、黑色素瘤和肉瘤以及腺癌和间皮瘤;可区别胸腺瘤、胸腺类癌、恶性淋巴瘤和生殖细胞瘤;可区别神经母细胞瘤、胚胎性横纹肌瘤、Ewing氏肉瘤、恶性淋巴瘤和小细胞癌;可区别纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤和恶性神经鞘瘤以及区别梭形细胞癌和癌肉瘤(杨光华,1992)[6-10]。1.4电镜在代谢性疾病诊断中的应用随着科学技术的进步,电镜的应用越来越广泛已有研究报道,电镜在肝脏代谢性疾病、软组织系统疾病诊断中的作用值得肯定。Mierau等(1997)认为电镜对影响儿童神经系统代谢储积性疾病的诊断起着决定作用,而且对此类疾病诊断特别是对那些需要明确界定的溶酶体储积病的诊断起着不可替代的作用。在肝脏代谢性疾病诊断中,如wilson病是一种先天的代谢性疾病,线粒体在早期的病理变化对病理诊断是非常有价值的。在软组织系统疾病诊断中Kyriacou等认为电镜对3种主要类型肌病的诊断很有用空泡性肌病;代谢性肌病;先天性肌病。这些疾病中大约15%～20%的肌肉活检需要进一步应用电镜检查资料作为最终诊断的前提[11-12]。1.5电子显微镜技术在病毒领域中的应用揭示病毒的结构或新病毒的发现与鉴别都是电镜的经典应用,因为病毒是最小的生命形态,只有应用电镜才可以对它进行直接观察,在整个生物医学界,利用电镜研究受益最多的是病毒学领域。目前,电镜技术不仅成为病毒快速诊断的常规技术手段,而且在肿瘤病毒基因及各种免疫病、腹泻病等重要研究领域中也起着不可替代的作用。一般组织内的病毒,可以利用超薄切片技术进行,通过取材、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、修块、超薄切片及染色后用透射电镜观察病毒大小、形态、排列及其复制组装、成熟的过程及病毒包涵体的形态特征。通过形态特征再结合病毒的核酸和蛋白分子生物学特性,可以对致病病毒进行鉴定和分类。鉴别诊断病毒的另外一种方法就是负染技术。电镜负染技术是一种快速简便的操作程序,是病毒性致病因子电镜诊断常用的方法,在新病毒的发现中作出了重要贡献。一般是将病毒分离提纯出来,分离提纯主要是将病毒从细胞中裂解出来,然后进行离心沉淀30min除去细胞碎片,取上清液制片,然后进行染色。如果病毒含量太少,则需制成悬浮液制片。制片后用磷钨酸染液染色约1min左右后晾干,然后上电镜观察病毒的形态、结构等特征以鉴别诊断病毒属性。负染色的特点是反差强,分辨力高,操作简便,节省时间,可以看到病毒的亚单位结构。免疫电镜技术能使抗原和抗体在超微结构水平上得到精细检测和定位。目前,国外研究人员已利用该项技术成功地检测出了猪传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)、犬细小病毒(CPV)、SV40病毒、轮状病毒、Sabin毒株及西方型马脑炎病毒(WEEV)。因此,病毒性疾病的诊断离不开电镜,电子显微技术是确定各种病毒形态结构最有用的工具。2、无机纳米粒子探针[14]在宏观领域和微观领域之间的介观领域—即纳米尺度范围内进行研究的纳米科技成为近年来研究的热点,开辟了人类科学研究的一个全新层次。由于纳米粒子的小尺寸效应、界面效应和量子效应等,导致了既异于传统的体相材料又异于分子原子等微观物质的独特性能,因此在许多领域得到广泛应用。以DNA双螺旋结构的发现为标志的分子生物学以及DNA重组技术与蛋白质重组技术的研究打开了现代生物技术的大门。如何将纳米技术与生命科学结合起来是当今科学面临的重要问题,备受关注。生命科学与纳米技术的交叉结合存在着许多从原理到技术的上的重大问题,如生物界面的兼容性,生物分子与纳米粒子的耦联等。已报道的方法多将纳米粒子用于生物标记和分析检测。下面主要从生物分子与纳米粒子的耦联方式,纳米金探针在生物学检测中的应用,2个方面的研究工作进行综述。2.1生物分子与纳米粒子的耦联方式把生物组分耦合或者修饰到纳米粒子表面主要有两种方法,第一是利用生物分子本身的官能团或者衍生的官能团在纳米粒子表面进行连接;第二是把纳米粒子表面改性,衍生出能够方便连接生物分子的官能团。通常湿化学法合成的纳米粒子在粒子表面都吸附有稳定剂(柠檬酸根,膦或者巯醇)，这些稳定剂不仅能够起到稳定作用还能够控制纳米粒子的增长以及抑制粒子之间的聚集。在柠檬酸根做保护剂时,生物分子可通过较强的键合配体直接与金属纳米粒子连接。例如免疫球蛋白(IgG)和血清白蛋白通过半胱氨酸残基上的巯基与胶体金连接。如果天然蛋白中没有这样的残基,可以用化学方法衍生巯基基团。同样也可在DNA的3c-或者5c-端衍生巯基基团,把DNA固定到金属和半导体纳米粒子上。还可以用连有巯基磷腺苷的DNA与金属纳米粒子直接反应。对于用柠檬酸盐或者硫辛酸保护的纳米粒子,生物分子还可以通过非共价静电作用连接.在高pH值条件下柠檬酸根保护的金和银纳米粒子显示电负性,而IgG分子显示电正性,通过静电作用可以把IgG分子固定在金属纳米粒子表面。利用静电作用修饰纳米粒子的方法还有氧化还原酶中的亚铁血红素与银纳米粒子表面的柠檬酸根的吸附以及半导体纳米粒子表面的硫辛酸与蛋白质的亮氨酸残基的结合。另外DNA分子还可以在电正性或者电中性的CdS纳米粒子表面吸附。通过研究固相基底与吸附生物分子之间的详细反应过程表明柠檬酸还原法制备的胶体银基底显示了良好的SERS效应和生物兼容性,还能够使酶蛋白质在其表面吸附后仍旧保持其生物活性。在纳米粒子表面改性方面主要有以下几个方面的工作.合成巯基配体包被的半导体纳米粒子,特别是半胱氨酸或者谷胱甘肽修饰的CdS和ZnS量子点和水溶性ZnS纳米晶体粉末。硅酸包覆的Cd/硫属纳米粒子表面的羟基可以通过硅烷化来共价键合各种生物分子,通过合成ZnS-CdSe核壳型纳米粒子,不仅能够提高纳米粒子荧光量子产率而且还改善了其水溶性,在表面修饰巯基乙酸能够显示较好的生物兼容性。上述耦合手段已经被用于纳米粒子和生物材料的连接制备纳米探针,但是针对无机纳米粒子的生物功能化还需要进行深入研究,尤其对于一些反应环境要求比较苛刻的生物组分,要求有合适的连接方式进行修饰还不能够失去其本身的生物活性。2.2纳米金探针应用于检测生物分子纳米金探针具有很多优点诸如较好的分辨率、稳定性和均一性,另外由于其尺寸小,因此通过改进穿透性可用于定量标记生物体的抗原位点。常规电子显微镜能够观测到金纳米晶体的最小的半径为1.4nm,当共价连接到抗体片断上时有7nm的空间分辨率.在组织学上,用表面吸附有抗体分子的金纳米粒子(10～40nm)特异性标记生物样品,对生物样品的不同区域进行标记、分析,而微小的金晶体(