抗菌药物敏感性试验(药敏试验)

内容简介药物选择及报告K-B法操作方法报告方式影响因素稀释法Etest联合药敏试验2010年CLSI更新内容简介目的指导临床医生针对各类临床感染患者选择最佳抗菌药物一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定药敏试验原理把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试细菌的琼脂平板上纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散作用形成递减的浓度梯度纸片扩散法纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感程度抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与其它诸因素相关。定量测定抗菌药物活性抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后种入试验细菌，孵育过夜。以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC）将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度相比较来确定恰当的临床疗效稀释法MIC的对数与抑菌环直径关系——近似线性负相关CLSI药物选择原则A组常规和首选药物，其结果应常规报告B组首选试验选择性报告。包含一些临床上重要的、特别针对医院感染的药物C组替代性和补充性药物U组补充性试验，仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物。表中小框内是一组类似药物，其结果解释和临床效力相似，不必个个试验。“或”字表示一群相关药物，其抗菌谱和解释结果几乎完全相同，交叉耐药性和交叉敏感性也完全相同，通常只选择一种药进行试验。药物选择菌种代表药物苯唑西林葡萄球菌属所有β-内酰胺类包括酶抑制剂复合药和碳青霉烯类四环素除葡萄球菌和不动杆菌以外的所有菌属多西环素、米诺环素、金霉素、地美环素、土霉素、美他环素红霉素革兰阳性球菌罗红霉素、克拉霉素、阿齐霉素、地红霉素药敏试验中常用试验药及其代表的药物所有菌属试验药物林可霉素克林霉素青霉素G葡萄球菌属淋病奈瑟菌苯氧甲基青霉素、苯氧乙基青霉素、氨苄西林、阿莫西林、巴氨西林、氨环己西林、海他西林、羧苄西林、美洛西林、阿洛西林、替卡西林、哌拉西林头孢噻吩肠杆菌科头孢匹林、头孢拉啶、头孢氨苄、头孢克罗、头孢羟氨苄氨苄西林所有菌属阿莫西林、巴氨西林、氨环己西林、海他西林磺胺异恶唑所有菌属所有磺胺类萘啶酸（敏感）肠杆菌科所有喹诺酮类敏感头孢噻吩/头孢唑啉（敏感）肠杆菌科所有头孢菌素敏感万古霉素革兰阳性杆菌替考拉宁氨苄西林肠球菌属青霉素B组药物细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告报告指征特定的标本来源多种细菌感染多部位感染对A组药过敏、耐受或无效以流行病学调查为目的向感染控制部门报告C组药物某些医院潜在局部或广泛流行的耐药菌株对数种手选药物（特别是同类的如β-内酰胺类或氨基糖甙类）耐药治疗对基本药物过敏的患者治疗少见菌的感染流行病学调查为目的向感染控制部门报告试验方法—纸片扩散法改良Kirby-Bauer法(K-B法)培养基非苛氧菌用Mueller-Hinton（M-H）琼脂药物纸片直径6mm纸片，每片吸水量约20μl菌液比浊管0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，菌液浓度为1.5×108/ml质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单胞菌ATCC27853试验材料操作方法菌液制备挑取已纯化的4~5个菌落制备菌悬液挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的菌落，用接种环接触每个菌落顶部转移至4~5mL适宜的液体培养基中（如胰酶消化大豆胨肉汤）生长法置35℃孵育2-6h用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至0.5号麦氏管从孵育16-24h的非选择性琼脂培养基上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮于生理盐水或肉汤中震荡混匀与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景调整其浊度相当于0.5号麦氏管。直接调制菌悬液法生长法的简便替代法用无菌棉拭子蘸取菌液在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀平板接种制备好的菌液必须在15min内使用贴纸片前可将培养皿盖半开3-5min以使表面过多水分被吸收但不超过15min将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干燥3-5min使平板上的水分被琼脂完全吸收。用镊子取纸片一张贴在琼脂平板表面，轻压使其与琼脂完全接触。纸片中心间距≥24mm,纸片中心距平皿边缘≥15mm。直径90mm的平板最好贴6张。加贴纸片15min内将平板倒置放温箱孵育。纸片一旦贴下就不可再挪动位置，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。需要时应在适当的地方贴新纸片注意必须用35℃孵箱（苛氧菌药敏平板应置于5%CO2环境）箱内平板最好单独摆放，不超过两个叠在一起，否则中间的平板因达不到孵箱温度而产生预扩散的作用。孵育平板孵育规定时间（一般为18-24h）后读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测苯唑西林和万古霉素的耐药性。孵育16-18h后检查每一块平板如果划线满意，接种物准确无误，抑菌圈应为正圆形，菌落应融合生长出现明显单个菌落表示接种量太少重复试验可用直尺或游标卡尺，读取最接近的整毫米数测量时应将尺子置于倒置的平板上，置平板在黑色无反射光背景上方几厘米处并用反射光照明。含血的药敏琼脂应移去平板盖后用反射光照明平板，于表面上方测量抑菌环。抑菌环直径测量测量抑菌环直径时抑菌环边缘以见不到细菌明显生长为限，测量的是完全抑制的区域直径（包括纸片直径）按抑菌环直径判断细菌的敏感性，应依据CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏感、中介、耐药。在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和药敏试验抗菌药物选择出的高频突变耐药株结果判断变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状爬行生长可以忽略。链球菌应检测其生长抑制圈而非溶血抑制圈。对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物使细菌轻微生长故抑菌圈直径应忽略细微生长的菌落。来自血琼脂菌落可能带有足够的甲氧苄啶或磺胺拮抗物，在SXT抑菌圈内细菌可沿敏感菌株周围产生模糊生长。检测苯唑西林和万古霉素对葡萄球菌和肠球菌的抑菌环需要用透射光（平板对着光源），抑菌环的边缘用放大镜才可发现小菌落可以忽略。在纸片周围的抑菌环内有任何可辨的菌落或生长薄膜（包括针尖样菌落）提示耐药。报告方式敏感菌株能被使用推荐剂量在感染部位达到的抗菌药物浓度所抑制常规报告中介被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组织中通常可达到的浓度而治疗反应率可能低于敏感株。意味着可通过提高剂量或在药物被生理浓集的部位发挥临床效力。被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组织或血液内达到的浓度所抑制其MIC落在某些范围内提示该菌可能存在特定的耐药机制（如β-内酰胺酶）而且治疗研究表明其临床疗效不可靠。耐药当药物对菌株的MIC高于或抑菌圈直径低于敏感折点时报告为非敏感。非敏感并不意味着菌株携带某种耐药机制。由于耐药菌株缺失或稀少因而仅确立了敏感性解释标准。对于“不敏感”菌株，鉴定和药敏结果需再次确认。不敏感（NS）M100-S20定义解释性报告某些菌种或菌群对抗菌药物的选择和报告有特殊要求大肠埃希菌和克雷伯菌属中产ESBLs菌株应报告对所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南耐药。对沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺异恶唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告第一、二代头孢菌素和氨基糖甙类药物体外可能有活性但临床无效故不应报告敏感沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性肠球菌对头孢菌素类、氨基糖甙类、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性但临床耐药，不能报告敏感。MRS应报告耐受所有β-内酰胺类药物（包括其复合药）从威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、会厌炎和面部蜂窝组织炎）患者的血和脑脊液中分离的流感嗜血杆菌常规应报告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉素的药敏结果。“警告”下列抗生素/微生物组合，在体外可出现活性但在临床上无效，不应报告敏感细菌不作为敏感报告的抗微生物药产ESBL肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌青霉素类、头孢菌素类和氨曲南沙门菌属、志贺菌属Ⅰ、Ⅱ代头孢菌素、头霉素和氨基糖苷类苯唑西林耐药葡萄球菌属所有青霉素类，头孢菌素类、β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂、碳青霉烯类肠球菌属氨基糖苷类(除外高浓度)、头孢菌素类、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑苛养菌药敏试验培养基为HTM（嗜血杆菌试验培养基）常规试验并不推荐用M-H巧克力琼脂过高的接种浓度对某些β-内酰胺类抗生素可造成假耐药的结果相当于0.5号麦氏管含菌1~4×108CFU/mL嗜血杆菌HTM氯化血红素母液氯化血红素50mg溶于100ml0.01mmol/L的NaOH，加热搅拌至完全溶解。NAD母液NAD50mg溶解于10ml蒸馏水，过滤除菌。HTM30ml氯化血红素母液加至1L含5g酵母粉的M-H琼脂中高压灭菌冷却后用无菌手续加入3ml的NAD母液淋病奈瑟菌培养基GC琼脂+1%的特定生长添加剂不推荐用高营养的巧克力琼脂作药敏若10μg青霉素纸片抑菌圈≤19mm，表示产生β-内酰胺酶。β-内酰胺酶试验更为迅速，为确认质粒介导耐药性的好方法。培养基含5%脱纤维羊血的M-H琼脂肺炎链球菌用苯唑西林测定对青霉素的敏感性，抑菌环直径≤19mm应测其MIC而不是直接报告对青霉素中介或耐药肺炎链球菌和其他链球菌肺链以外的链球菌不推荐用苯唑西林试验对于草链，青霉素（或苯唑西林）纸片扩散试验是不可靠的，无菌部位分离的草链应测其青霉素的MIC。适用于肠杆菌科细菌等快速生长的致病菌无论哪种接种方式，只要质控菌种的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告药敏结果为WHO推荐药敏方法专性厌氧菌及酵母样菌等某些特殊菌种药敏试验不能用纸片法特点技术简单，试剂量低，不需要特殊设备，可自由选择抗菌药物，可重复，易于由人判断，故必须标准化。纸片法药敏试验必须标准化影响因素M-H培养基批间重复性较好含有磺胺、甲氧苄啶和四环素的抑制物很少绝大多数非苛养菌生长良好已积累大量的数据和经验按商用脱水培养基说明制备高压灭菌后水浴冷却至45-50℃水平台面上倾注平皿，厚度均匀一致约4mm，150mm平皿倒60-70mL，100mm平皿倒25-30mL培养基配制冷却至室温，若当天不使用应贮存于2-8℃冰箱制备后7天内使用完毕每批平板均应进行抽样进行无菌试验，30-35℃孵育24h或更长时间。检查每批M-H琼脂的pH，胶化后室温下为7.2-7.4过低、过高会使某些药物失去效力（如氨基糖甙类和大环内酯类）或活性可能增强（如青霉素类）。pH若使用前琼脂表面过分潮湿，应放35℃孵箱或在室温下敞开盖子倒置，直至多余水分蒸发。琼脂表面应保持湿润在接种后琼脂表面或平板的盖子表面不应有可见的潮湿水珠湿度过量胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶可逆转磺胺类和甲氧苄啶的抑菌效应而使抑菌环变小、模糊甚至消失而导致假耐药的报告，应使用胸腺嘧啶核苷含量尽可能低的M-H琼脂。评价新的M-H琼脂可用甲氧苄啶/SMZ纸片对粪肠球菌ATCC29212或粪肠球菌ATCC33186进行试验胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶影响不合格培养基没有抑菌圈抑菌圈内有菌生长抑菌环直径＜20mm合格培养基培养基上出现边缘清楚的抑菌环直径为20mm或更大主要指镁和钙影响氨基糖甙类、多粘菌素和四环素对假单胞菌的试验结果含量过高抑菌圈变小含量过低抑菌圈变大甚至不可接受锌离子主要影响细菌对碳青霉烯的敏感性二价阳离子含量的影响培养条件非苛氧菌解释标准的基础是在空气中孵育。某些药物（氨基糖甙类、大环内酯类和四环素）受CO2影响抑菌环直径会有较大改变，非苛氧菌不能在CO2浓度较高的环境中孵育。苛氧菌应在CO2环境孵育中纸片的贮存装有纸片的容器应置于非无霜冰箱中，≤8℃冷藏或≤-14℃冷冻至使用前某些不稳定药物（如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸复