酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理方法类型及反应原理、、、、试剂制备试剂制备试剂制备试剂制备和和和和临床意义临床意义临床意义临床意义酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单克隆抗体技术（使各种对抗原决定簇高度特异的单克隆抗体可以在体外批量生产）、生物素－亲和素放大系统的应用以及与化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高民分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程度，使酶免疫技术不断更新，应用范围不断拓宽。当前，酶免疫技术已与形式各异、各具特点和用途的定位、定量和超微量测定的标记免疫分析技术融合发展，在医学和生物学中的应用日益广泛，是取代放射免疫技术的主要方法之一。酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点酶免疫技术是以酶标记抗原或酶标记抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被测物进行定性或定量的标记免疫技术。基本原理基本原理基本原理基本原理是：将酶与试剂抗原或抗体用交联剂结合起来，此种酶标记抗原或抗体与标本中相应抗体或抗原发生特异反应，并牢固结合，在加入相应的酶的底物时，底物被酶催化生成呈色产物，在免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和定位，在酶免疫测定中，则可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点，而且，可与其他技术偶联而衍生出适用范围更广的新方法。①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某重酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。③标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类：：：：一一一一、、、、按检测对象的不同一般分为两类按检测对象的不同一般分为两类按检测对象的不同一般分为两类按检测对象的不同一般分为两类：：：：1.酶免疫组织化学技术（enzymeimmunohistochemistry,EIH）:用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体。2.酶免疫测定技术(enzymeimmunoassay,EIA):用于检测体液样本中可溶性抗原或抗体。二二二二、、、、根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物，，，，可分为可分为可分为可分为：：：：1.均相法（homogenous）：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接进行测定。2.异相法(heterogenous)：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进行测定。酶免疫组化酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测定固相酶免疫测定异相酶免疫测定液相酶免疫测定必备试剂必备试剂必备试剂必备试剂：：：：①固相抗原或抗体------免疫吸附剂②酶标记的抗原或抗体------酶结合物③酶反应的底物------底物酶联试剂阳性对照酶标记物显色液A终止液反应板显色液B浓缩洗涤液加样枪与吸头阴性对照双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。工作原理工作原理工作原理工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体固相抗体固相抗体固相抗体-抗原抗原抗原抗原-酶标抗体免疫复合物酶标抗体免疫复合物酶标抗体免疫复合物酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法双位点夹心法双位点夹心法双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。【操作步骤】双抗原夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗体的ELISA。工作原理工作原理工作原理工作原理是：利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子上两个抗原结合位点结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物。由于反应系统中固相抗原和酶标抗原的量相对于待测抗体是过量的,因此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗体含量。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法-操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤：：：：⑴将特异性抗原包被固相载体。孵育一定时间，使形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原和杂质。⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗体与固相载体上的抗原充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。⑶加酶标抗原，孵育，使形成固相抗原-待测抗体-酶标抗原夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗原。⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗体的量。间接法间接法间接法间接法此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。基本原理基本原理基本原理基本原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原固相抗原固相抗原固相抗原-受检抗体受检抗体受检抗体受检抗体-酶标二抗复合物酶标二抗复合物酶标二抗复合物酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。【操作步骤】竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。方法和特点方法和特点方法和特点方法和特点:①①①①酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力②②②②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和③③③③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比【【【【操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤】】】】捕获法捕获法捕获法捕获法捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，则后者可干扰IgM的测定。工作原理工作原理工作原理工作原理：先将针对IgM的第二抗体（如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以结合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异），洗涤出去IgG等无关物质，然后加入特异抗原与待检IgM结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗固相二抗固相二抗固相二抗-IgM-抗原抗原抗原抗原-酶标抗体复合物酶标抗体复合物酶标抗体复合物酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。全自动设备全自动设备全自动设备全自动设备：酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有β-半乳糖苷酶、尿酶等。1.辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)应用最广泛。是从辣根菜中提取的酶类，由糖蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在403nm波长处有最大吸收峰，糖蛋白在275nm波长有最大吸收峰，故用A403nm与A275nm比值代表纯度（reinheirzahl,RZ）。用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ不变但活力下降。HRP的底物有可溶性和不溶性两种的底物有可溶性和不溶性两种的底物有可溶性和不溶性两种的底物有可溶性和不溶性两种。不溶性底物不溶性底物不溶性底物不溶性底物用于酶免疫组化技术：①3，3`-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB），显色时呈棕黄色；②3-氧基-9-乙基卡唑，呈红色；③α-萘酚；④4-氯-1-萘酚，呈灰蓝色；可溶性底物可溶性底物可溶性底物可溶性底物用于酶免疫测定技术：①邻苯二胺（OPD），呈橙红色，测定波长为492nm，敏感性高，颜色稳定可维持数小时，对光敏感；②四甲基联苯胺（TMB），呈黄色，测定波长为450nm；③5-氨基水杨酸（5-ASA），呈棕色，测定波长为550nm；2.碱性磷酸酶（alkalinephospharase,AP）可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，敏感性高，空白值低。AP不溶性底物不溶性底物不溶性底物不溶性底物：①硝基蓝四氮唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）混合液，是AP最敏感的底物，呈紫色；②坚牢红和萘酚ASMX混合液，呈红色AP可溶性可溶性可溶性可溶性底物一般采用对硝基苯磷酸酯（P-nitrophenylphosphate,P-NPP），产物呈黄色，测定波长为405nm。酶标记物的制备酶标记物的制备酶标记物的制备酶标记物的制备酶标记物的制备：抗原由于化学结构的不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质，可参照抗体酶标记的方法，酶标记抗体的制备一般用戊二醛法和过碘酸盐法。1.戊二醛法戊二醛法戊二醛法戊二醛法：戊二醛是一种双功能团的交联剂，分别与酶分子和免疫球蛋白分子上的氨基结合。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。⑴⑴⑴⑴一步法：将2～5mg纯抗体与5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸盐缓冲液1ml中，4℃下用同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室温下放置2h，在4℃下用0.05mol/LpH8.0Tris缓冲液透析平衡，即可。⑵⑵⑵⑵二步法：第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合，形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物。2.过碘酸盐法过碘酸盐法过碘酸盐法过碘酸盐法：⑴⑴⑴⑴取：HRP5mg溶于0.2mol／LpH5.6醋酸盐缓冲液0.5ml中，充分溶解后加入临用前配制的0.1mol／LNaIO40.25ml，混匀，于4℃氧化30min（勿超过）。⑵⑵⑵⑵加入2.5%乙二醇0.5ml，室温下放置30min终止氧化。⑶⑶⑶⑶加入侍标记抗体（γ球蛋白或IgG）或抗原5～10mg，用1.0mol/LpH9.5CBS调pH至9.0，混匀。4℃过夜，使HRP与抗体或抗原结合。⑷⑷⑷⑷加NaBH40.1ml（0.5mg），混匀，4℃2h，使形成的酶结合物稳定。用0.01mol／LpH7.4PBS透析，4℃过夜平衡。用戊二醛法和过碘酸盐法标记后，应将酶标记物纯化，常用的提纯方法为50%饱和硫酸铵和SephadexG200(或G150)凝胶过滤。标记率测定：标记率以A403nm／A280nm比值表示，是HRP的正铁血红素辅基特异吸光度(A403nm)与抗体球蛋白和酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸等的吸光度(A280nm)之比，表示酶标抗体中HRP所占的比例。标记率与HRP／IgG摩尔比（E／P）呈高度正相关。标记率为0.4时，E／P之比约为1。一般以标记率0.3～0.6为合格。固相载体固相载体固相载体固相载体固相载体：最常用聚苯乙烯，载体形状有小试管、小珠和微量反应板。良好的载体应该是吸附性能好、不参与化学反应、能使抗原或抗体保持免疫学活性、空白值低且透明度高。