第四章-酶的提取与分离纯化

第四章酶的提取与分离纯化（1）细胞的破碎、酶的抽提重点（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、膜过滤、层析分离、电泳分离（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型本章知识点：一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标产物成为现实。大多数酶的回收纯化过程成本约占70%；医用酶的生产回收过程的成本高达85%；基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上。二、分离纯化的一般流程原料液细胞分离（离心、过滤）细胞（胞内产物）清液（胞外产物）细胞破碎碎片分离粗分离纯化成品化线路2线路1首先，应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的了解;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力回收率和纯化倍数为指标；再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件；最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降，酶更不稳定，因此，更要防止酶变性。在实践工作中选择方法时:三、酶分离纯化的基本原则（一）酶分离纯化包括三个基本环节抽提纯化制剂（二）酶分离纯化应注意以下问题1、防止酶变性失活：热、pH、泡沫、重金属等。2、选择有效的纯化方法。3、酶活性测定应贯穿纯化过程的始终。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。第一节细胞破碎——只对胞内酶细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖：N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖藻类：纤丝状多糖类细胞破碎的方法：1）机械破碎法2）物理破碎法3）化学破碎法4）生物法（酶解）利用机械力的搅拌，剪切或研碎细胞。组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。（一）机械破碎法通过温度，压力，声波等各种物理因素的作用，将组织细胞破碎的方法，冻融法、压差法、超声波法（二）物理破碎法1）超声波：通过剪切力和空穴作用（30mg蛋白/ml,30-60sec/次）2）渗透压变化：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。3）冻融：反复低温冰冻，室温融化。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法。有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。非离子型表面活性剂处理：改变膜通透性，使之溶解，再提膜蛋白。常用TritonX-100、Tween等。（三）化学破碎法自身的酶或外加酶制剂。（1）自溶法（2）酶处理选用各种溶壁酶（如溶菌酶）等处理菌体细胞，使细胞壁破坏，酶释放出来。革兰氏阳性菌：加溶菌酶。酵母细胞：加β-葡聚糖酶，使其β-1,3葡聚糖水解。霉菌：用几丁质酶。植物细胞：用纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的混合物。（四）酶促破碎法第二节提取（一）抽提方法指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的抽提。四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂，水。（二）抽提过程中的注意事项1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；最好远离待抽提酶的等电点。2、温度：通常控制在0~10℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。3、抽提液体积（用量）抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。第三节酶的沉淀分离一、盐析沉淀法(saltingout)1、原理：2、硫酸铵盐析的优点优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小；②价廉易得；③可保护酶。缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。遇碱会放出NH4+，干扰蛋白质测定；对离心机等有腐蚀作用；酶制剂若用于食品，会影响口感。3、盐析操作硫酸铵的饱和度×100%（NH4）2SO4的饱和度（%）=饱和硫酸铵的体积混合溶液总体积(25℃)当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实验确定。（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。（5）脱盐：超滤、透析或层析。（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0%为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。（二）等电点沉淀(isoelectricprecipitation)1、原理2、实际操作与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。3、注意加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。(三)有机溶剂沉淀在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀。实际操作中常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇等。温度0℃下操作。有机溶剂先在-15℃～-20℃下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离。pH值：尽可能靠近其等电点。沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度。（四）复合物沉淀法1、原理2、常用的复合沉淀剂：单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸（PAA）等高分子聚合物。PAA+酶PAA-酶PAA-酶PAA+酶PAA+酶+Ca2+PAA-Ca2++酶PAA-Ca2++SO42-CaSO4+PAApH6以上（五）选择性变性沉淀法1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。第四节膜过滤技术在酶分离纯化中的应用MembraneFiltration膜过滤技术（membranefiltration）：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。渗出液膜分离技术的地位和影响美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研究和开发。“谁掌握了膜技术，谁就掌握了化学工业的未来”-NormanN.Li，美国科学院院士，著名华裔科学家。膜分离已得到广泛应用。21世纪是工业生物技术的世纪，膜技术将扮演重要角色。一、膜分离的类型1、按推动力不同可分为：（1）加压膜分离：微滤（Microfiltration）、超滤（Ultrafiltration）、纳滤（Nanofiltration）、反渗透（ReverseOsmosis）（2）电场膜分离：电渗析（Electrodialysis）（3）扩散膜分离：渗透（Osmosis）、透析（Dialysis）2、按膜孔径或截留物质的大小：微滤——超滤——纳滤、电渗析、透析——反渗透膜孔径大小类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透20Å生物小分子、盐、离子(留下来的是超纯水）反渗透膜（海水的淡化处理）（一）微滤(MF)又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。（1）截留颗粒直径：0.2~2um。（2）操作压力：低于0.1MPa。（3）应用：实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵液中的细胞。无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药物和营养物质的过滤除菌等.二、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术细胞水盐大分子小分子（二）超滤(UF)可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。（1）截留颗粒直径：10~200nm。（2）操作压力：0.1~0.7MPa。（3）应用：一是分离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。大分子水盐小分子纳滤膜主要用于截留粒径在2～10nm，分子量为1000左右的物质，可以使盐和小分子物质透过，操作压（0.5～1MPa）。其被分离物质的尺寸介于反渗透膜和超滤膜之间，但与上述两种膜有所交叉。（三）纳滤(NF)水盐小分子大分子（四）反渗透(RO)在压力作用下，溶剂（通常是水）透过膜，而溶质被阻挡于膜壁外。（1）截留颗粒直径：小于2nm。（2）操作压力：0.7~13MPa。（3）应用：主要用于分离各种离子和小分子物质。在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛应用。溶质水水膜溶质水水膜渗透反渗透水盐小分子大分子反渗透（RO）（五）电渗析在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离的目的。酶液膜膜+-+-应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备等透析袋酶溶液蒸馏水应用：在生物分离方面，主要用于生物大分子溶液的脱盐。由于透析过程以浓差为传质推动力，膜的透过通量很小，不适于大规模生物分离过程，而在实验室中应用较多。（六）透析盐类水膜透析水膜渗透1、若除去酶溶液中的盐分，可采用下面哪种分离方式？（）A、板框过滤B、微滤C、超滤D、反渗透2、若除去酶溶液中的生物小分子，可采用下面哪种分离方式？（）A、板框过滤B、微滤C、超滤D、反渗透3、在采用微生物发酵生产壳聚糖酶时，若采用膜过滤的方法除去发酵液中的菌体细胞，可采用哪种膜分离方式？用生产所得的壳聚糖酶来降解壳聚糖生产壳寡糖时，反应完成后，可采用哪种膜分离方法除去反应液中的壳聚糖酶？练习：三、膜分离技术的基本流程渗出液膜组件料液罐浓缩液（回流液）泵中空纤维超滤器中空纤维膜分离装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。当轴流通过管腔时，造成高剪切力，在截留溶质分子的同时，将浓度降至最低限度。每根中空纤维内腔直径为0.2mm,中空纤维由惰性的非离子聚合物制成．具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维表面积大，流量大、阻留溶质的浓度范围(4％一20％左右)如右图。四、生产中常用的膜分离装置中空纤维超滤膜组件清洗液清洗液出口渗出液渗出液（c）五、膜及膜的使用性能（一）膜的结构膜表层：孔径各异，厚度为0.1~5um基层：起支持作用，厚度为50~250um主要有：陶瓷、微孔玻璃、不锈钢和碳素等。适用：微滤膜。特点：是机械强度高，耐高温、耐化学试剂和耐有机溶剂，但缺点是不易加工，造价较高。1、无机材料（二）制膜材料目前，实用的有机高分子膜材料有：纤维素酯类、聚砜类、聚酰胺类及其他材料。可用作反渗透膜、微滤膜和超滤膜。2、有机高分子材料（1）透水率（透水通量、流率）：是指在一定温度和压力条件下单位膜面积在单位时间内透过的水量。处理蛋白质（酶）溶液时，透水率常为纯水的10%。（2）截留率：是指溶液中某一溶质被膜截留量的百分数。酶超滤浓缩通常选用90%以上截留率的膜。（3）截留物相对分子质量：是指某种大分子如酶，在截留率达到某一指标情况下的被截留物的分子量。（三）膜的使用性能第五节离心技术（centrifugation）在酶分离纯化中的应用离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。（一）离心机分类低速离心机：＜8000r/min用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒。高速离心机：8000~25000r/min用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等。超速离心机：＞25000r/min用途：制备用超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等。分析用超速离心机：测定样品纯度、沉降系数、相对分子量。实验室离心机温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻