糖尿病小鼠血糖波动模型的建立及其对脏器损伤的研究

:042727104(2008)0520647205:2008201221:涂白青(1982)),男,硕士研究生;通讯联系人叶希韵,女,副教授,E2mail:[e-mail].,,,(华东师范大学生命科学学院,上海200062):通过建立糖尿病小鼠的血糖波动模型,研究血糖波动对糖尿病小鼠各脏器氧化损伤以及对糖尿病并发症相关实验指标的影响.将实验小鼠分为四组,正常组小鼠、正常小鼠血糖波动组、糖尿病小鼠组、糖尿病小鼠血糖波动组.首先通过尾静脉注射四氧嘧啶5mg/kg体重建立小鼠糖尿病模型,正常波动组和糖尿病波动组每天3次腹腔注射葡萄糖2g/kg体重以造成小鼠的血糖波动,其余两组腹腔注射生理盐水,各组小鼠均自由进食进水.实验6周后采血,检测血清中血糖、果糖胺含量以及各脏器中丙二醛、谷胱甘肽、山梨醇等的含量.糖尿病波动组小鼠的血糖、果糖胺水平、各脏器的氧化损伤程度和山梨醇含量都显著高于糖尿病组(P0.01).说明血糖波动能加重糖尿病小鼠的病情,并对脏器造成更为严重的损伤,这有可能是导致糖尿病并发症发生的原因之一.:血糖波动;糖尿病小鼠;糖尿病并发症;氧化损伤;模型建立:R587.1:A高血糖是糖尿病的标志以及导致慢性并发症的主要原因,高血糖的不良作用主要是以慢性持续高血糖和血糖水平波动两种方式体现的[1].近年来有研究报道[2],糖尿病的预后及慢性并发症的发生和发展不仅与整体血糖水平的升高密切相关,而且与患者的血糖波动有密切关系.糖尿病患者血糖波动越大,慢性并发症的发生率越高、预后就越差.临床研究显示[3],长期的血糖波动比慢性持续高血糖对人体的危害更加严重.体外细胞培养研究还发现[428],间歇性葡萄糖浓度波动会导致肾小球系膜细胞,血管内皮细胞等发生不同程度的损伤.由于糖尿病病人一天中的血糖浓度是呈锯齿形不断变化的,餐后血糖水平快速升高是糖尿病病人典型的、常见的临床症状.本文通过模拟餐后高血糖引起糖尿病患者血糖波动的情形,建立了糖尿病小鼠的血糖波动模型,初步研究了血糖波动对糖尿病小鼠肾脏、肝脏、心脏的氧化损伤情况,以及对血糖、果糖胺、山梨醇含量的影响,旨在通过动物实验进一步探讨血糖波动对糖尿病小鼠造成的危害,以及血糖波动与糖尿病并发症之间的关系,为今后深入的机制研究打下一定的实验基础并提供了可操作的实验动物模型.1材料与方法1.1葡萄糖(GLU)购自上海化学试剂公司;四氧嘧啶(Alloxan)购自Sigma;辅酶Ñ(NAD+)购自上海鼎国生物科技有限公司;葡萄糖氧化酶法测定试剂盒和果糖胺试剂盒购自上海科欣生物技术研究所;丙二醛(MDA)试剂盒和谷胱甘肽(GSH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所.其他化学药品均为国产分析纯.1.2雄性昆明小鼠,体重在25~30g,中科院上海斯莱克实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)200320003.第47卷第5期2008年10月复旦学报(自然科学版)JournalofFudanUniversity(NaturalScience)Vol.47No.5Oct.20081.3从60只雄性昆明小鼠中随机各取出8只作为正常组和正常波动组.其余所有小鼠禁食12h后,尾静脉注射以0.9%的生理盐水配制的5mg/mL四氧嘧啶溶液,注射量为50mg/kg体重,5d后,禁食6h取小鼠尾静脉血用葡萄糖氧化酶法测定试剂盒测血糖值.选取血糖值介于16~20mmol/L的小鼠16只作为糖尿病组和糖尿病波动组.1.4正常组(N)、正常波动组(F)、糖尿病组(M)、糖尿病波动组(M+F),每组各8只小鼠.1.5取正常小鼠和已成糖尿病模型的小鼠各8只,每天3次腹腔注射葡萄糖2g/kg体重,每只小鼠每次注射0.5mL,第一次注射时间为每天早上的8:00,第二次注射时间为每天中午12:00,第三次注射时间为每天下午16:00.另外取正常小鼠和已成模型的糖尿病小鼠各8只,按照以上时间和方法腹腔注射0.9%的生理盐水0.5mL.每周进行1次全天7个时间点的血糖检测,以检查波动的规律性.连续注射6周后,采血,并将各组小鼠脏器(肾脏,肝脏,心脏)及眼球组织制成匀浆液备用.1.6血糖、果糖胺、丙二醛、谷胱甘肽、山梨醇、肝糖原均按试剂盒的方法检测.1.7实验数据均以平均数?标准差(X)?SD)表示,组间差异比较采用t检验.以上统计用Excel软件分析.2结果与分析2.1通过对正常小鼠和糖尿病小鼠一日3次灌胃和腹腔注射葡萄糖来实现小鼠血糖的反复波动,比较结果显示腹腔注射葡萄糖建立的血糖波动模型更为稳定,因此本实验选择以腹腔注射葡萄糖来建立糖尿病小鼠血糖波动模型.选取实验第六周全天各组小鼠血糖波动的变化情况,结果显示,糖尿病小鼠腹腔注射葡萄糖30min后,血糖会达到峰值,经过4个小时,到第二次注射前血糖基本恢复到原先血糖的水平,甚至略有降低.这样1天12h内形成3个明显的血糖波动高峰.无论是正常小鼠还是糖尿病小鼠,均能通过人为腹腔注射葡萄糖形成血糖波动,与没有注射的对应组比较有显著的差异(P0.01).且糖尿病小鼠的血糖波动幅度比正常小鼠的血糖波动的幅度明显增大(表1).1(X)?SD,n=8)Tab.1VarianceofBGFofvariousmicegroupsonthesixthweek组别8:008:3012:0012:3016:0016:3020:00N7.95?0.527.61?0.437.35?0.577.42?0.817.72?0.797.36?0.477.87?0.95F7.74?0.7511.47?0.93*7.16?1.0212.29?1.21*6.95?1.1312.84?0.96*6.69?0.87M19.67?1.33**19.21?1.64**19.49?1.97**19.95?2.06**19.68?1.72**19.87?1.45**19.26?2.31**M+F23.44?2.28**v33.91?2.15**vv24.79?2.69**v37.24?3.13**vv25.21?2.36**vv35.48?2.81**vv24.73?2.92**v注:与N组比较,*P0.01,**P0.001;M+F组与M组比较,vP0.01,vvP0.001,以下各表中的标记与此说明相同.2.2动物实验6周后,检测各组小鼠血清中血糖、果糖胺水平,结果表明,糖尿病组小鼠的血糖和果糖胺含量显著高于正常组小鼠,差异显著(P0.01).血糖波动后,正常波动组小鼠的果糖胺含量也明显高于正常组小鼠.糖尿病波动组小鼠的果糖胺同样显著高于糖尿病组,说明不论正常组还是糖尿病组血糖波动后都会引起果糖胺含量的升高(表2).2.3MDA、GSH实验结果表明,糖尿病组小鼠的肾脏组织中MDA和山梨醇含量明显高于正常组,而GSH的含量则648复旦学报(自然科学版)第47卷明显低于正常组差异显著(P0.01).正常波动组与正常组比较,其MDA含量明显高于正常组(P0.05),说明长期的人为造成血糖波动对动物的肾脏还是有一定的氧化损伤.糖尿病波动组与糖尿病组比较各组数据差异都非常明显(P0.01).说明糖尿病小鼠血糖波动后不仅会引起肾脏组织脂质过氧化水平的升高而且会导致糖尿病并发症相关指标山梨醇含量的升高,从而对肾脏造成一定的损害(表3).2(X)?SD)Tab.2Contentsofglucoseandfructosamineinserumofmice组别血糖(mmol/L)果糖胺(mmol/L)N7.54?0.722.65?0.34F7.82?0.873.08?0.57*M19.75?1.93**3.97?0.48**M+F25.51?2.46**vv4.86?0.35**v注:各组小鼠都为8只.3MDA、GSH(X)?SD)Tab.3ContentsofMDA,GSHandsorbitolinkidneytissuesofmice组别MDA(mmol/L)GSH(mg/gprot)山梨醇(mmol/L)N1.75?0.61141.23?2.560.78?0.13F2.31?0.78*132.57?3.190.82?0.11M3.28?0.52**98.23?4.18**1.17?0.24**M+F4.42?0.83**vv72.35?5.85**vv1.59?0.27**vv注:各组小鼠都为8只.4MDA、GSH(X)?SD)Tab.4ContentsofMDA,GSHandsorbitolinlivertissuesofmice组别MDA(mmol/L)GSH(mg/gprot)山梨醇(mmol/L)N0.63?0.64112.17?3.320.43?0.21F0.84?0.75*96.42?4.25*0.48?0.37M1.11?0.53**81.35?3.79**0.71?0.48**M+F1.39?0.82**vv65.47?5.13**vv0.88?0.43**vv注:各组小鼠都为8只.2.4MDA、GSH实验结果表明,糖尿病组小鼠的肝脏组织中MDA和山梨醇含量均明显高于正常组,而GSH的含量则明显低于正常组差异显著(P0.01).正常波动组与正常组比较,MDA含量明显高于正常组(P0.05),而GSH的含量明显低于正常组(P0.05),说明长期的人为造成血糖波动对正常动物的肝脏同样具有氧化损伤.糖尿病波动组与糖尿病组比较各组数据差异都十分明显,说明糖尿病小鼠血糖波动后会加剧肝脏组织脂质过氧化水平的升高和糖尿病并发症相关指标山梨醇含量的明显升高,对肝脏产生明显的损害作用(表4).2.5MDA、GSH实验结果表明,糖尿病组小鼠的心脏组织中MDA和GSH的含量与正常组比较有显著差异(P0.05).糖尿病波动组与糖尿病组比较各组数据也有明显差异(P0.05).在心脏组织中各组的山梨醇含量差异较小.说明糖尿病血糖波动后主要引起心脏组织的脂质过氧化水平的升高(表5).2.6实验结果表明,正常波动组与正常组比较,其眼球山梨醇的含量明显升高(P0.05),糖尿病组与糖尿病波动组的眼球山梨醇含量与正常组比较,差异显著(P0.01),糖尿病波动组与糖尿病组比较也是差异显著(P0.01).说明血糖波动对小鼠眼球糖尿病并发症敏感指标山梨醇的影响非常显著(表6).5MDA、GSH(X)?SD)Tab.5ContentsofMDA,GSHandsorbitolinhearttissuesofmice组别MDA(mmol/L)GSH(mg/gprot)山梨醇(mmol/L)N2.24?0.85118.41?4.770.55?0.34F2.47?0.93105.31?5.790.59?0.52M3.31?1.22*94.84?5.92*0.63?0.47*M+F3.86?1.17*v77.25?6.48*v0.68?0.53*v注:各组小鼠都为8只.6(X)?SD)Tab.6Contentofsorbitolineyeballsofmice组别小鼠数/只山梨醇(mmol/L)N80.48?0.21F80.63?0.33*M80.72?0.37**M+F80.91?0.45**vv649第5期涂白青等:糖尿病小鼠血糖波动模型的建立及其对脏器损伤的研究3讨论临床研究表明糖尿病病人餐后高血糖的危害性极大,这对于糖尿病并发症的发生有着重要的影响[2].糖尿病并发症易引起全身各脏器及组织发生病理改变,包括心、脑、血管、眼、神经、肾脏等,严重危害人体健康.本实验通过建立糖尿病小鼠餐后血糖波动模型来研究人为造成的血糖波动与动物血糖水平、各脏器氧化损伤以及糖尿病并发症相关实验指标如果糖胺、山梨醇等的相关性.研究结果表明通过腹腔注射葡萄糖建立的血糖波动模型有以下两方面的优点:(1)血糖升高幅度明显,重复性好.(2)操作方法简单,模型稳定.糖尿病模型小鼠进行血糖波动后,其/三多一少0的糖尿病病理症状明显加重,从血糖水平也能反应出糖尿病小鼠波动组的血糖明显有所升高,说明血糖波动对糖尿病小鼠的病情有加重的作用.血清中