毛细管电泳技术及应用-PPT课件

毛细管电泳技术及应用电泳在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1808年，Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白质混合液的分离：发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；经典电泳利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——毛细管电泳。毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis,CE）高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：1.采用了25-100μm内径的毛细管；2.采用了高达数千伏的电压。•毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。•电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，•毛细管电泳的柱效远高于HPLC，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。分离过程电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；3.操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；一、CE基本原理二、电渗现象与电渗流electroosmoticflow三、影响电渗流的因素四、淌度mobility五、CE中的参数与关系式六、影响分离效率的因素毛细管电泳理论基础毛细管电泳(CE)基本原理电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηγ；γ—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)所以，迁移速度：EqfqEπ6（球形离子）物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度μ：单位电场强度下的平均电泳速度。π6qEq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；γ—离子的表观液态动力学半径η—介质的粘度；电渗现象与电渗流electroosmosisandelectroosmoticflow1.电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。2.HPCE中的电渗现象与电渗流石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。3.CE中电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即ν电渗流=μE电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即μ=ε0εξε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。ν电渗流=ε0εξE实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算ν电渗流=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。CE中电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向负极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向正极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向正极。4.CE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。5.CE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在CE中，控制电渗流非常重要。CE中影响电渗流的因素1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；3.电解质溶液性质的影响（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。4.温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；5.添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。（3）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。淌度Mobility淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1.绝对淌度(absolutemobility)μab无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度(effectivemobility)μef实际溶液中的淌度(实验中测定的)。μef=∑aiμiai—溶质i的解离度；μi—溶质i在解离状态下的绝对淌度CE中的参数与关系式1.迁移时间（保留时间）CE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。VLLELLtapefapefapefV—外加电压；L—毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）在CE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt22/154.5;22YtnDELDLVLnRefapefap扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。3.分离度DLVLRefap平均177.0影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：221apap平均1212)(2WWttR影响分离效率的因素—区带展宽1.纵向扩散的影响在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24Dt)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。3.焦耳热与温度梯度的影响电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：22πEcΛLrIVQbmm—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；4.溶质与管壁间的相互作用存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。5.其他影响因素（1）电分散作用对谱带展宽的影响当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响一般情况下，CE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。一、高效毛细管电泳仪二、流程与主要部件三、进样方式四、检测器毛细管电泳仪仪器流程与主要部件•电压：0～30kV；•分离柱不涂敷任何固定液；•紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19～10-21mol/L）1.高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2.毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；（2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度=1m3.缓冲液池化学惰性，机械稳定性好；4.检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；类型检测限/mol特点紫外-可见10-13～10-15加二极管阵列，光谱信息荧光10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-20灵敏度极高，样品需衍生电导10-18～10-19离子灵敏，需专用的装置；CE具体操作步骤：毛细管电泳的基本步骤包括清洗毛细管、更换电泳缓冲液、进样、电泳并同时在线检测。1).清洗毛细管对于一根新的或久未使用的毛细管，需用1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/LNaOH溶液、超纯水依次清洗。在有些情况下还需用0.1mol/LHCl、甲醇或去垢剂清洗,强碱溶液可以清除吸附在毛细管内壁的油脂、蛋白质等，强酸溶液可以清除一些金属或金属离子，甲醇、去垢剂可去除疏水性强的杂质。在进行每次分析前可用相当于毛细管总体积2~3倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般为2~3min，而后注入电泳缓冲液，以保证分析结果的重复性。2).更替电泳缓冲液在进行每次分析前