第2章核酸

第2章核酸2.1核酸的分类、结构和合成核酸(nucleicacid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。核酸的分类及分布90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。2.1.1核酸的化学组成及分类核酸的化学组成1.元素组成C、H、O、N、P（9~10%）2.分子组成——碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱——戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖——磷酸(phosphate)嘌呤(purine)NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤(adenine,A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤(guanine,G)碱基NNH132456嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)NNHNH2O尿嘧啶(uracil,U)NHNHOO胸腺嘧啶(thymine,T)NHNHOOCH3戊糖（构成RNA）1´2´3´4´5´OHOCH2OHOHOH核糖(ribose)（构成DNA）OHOCH2OHOH脱氧核糖(deoxyribose)核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR一、核苷酸的结构1.核苷(ribonucleoside)的形成碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）。OHOCH2OHOHNNNH2O1´1糖苷键脱氧核苷酸2.核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。5´端3´端3.核苷酸的连接核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。CGA二、核酸的一级结构定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。5′端3′端CGAAGP5PTPGPCPTPOH3书写方法5pApGpTpGpCpT-OH35AGTGCT32.1.2核酸的结构一、DNA的结构1953年Watson和Crick在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型。1．DNA双螺旋结构DNA分子由两条DNA单链组成。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。（一）DNA双螺旋结构的研究背景碱基组成分析Chargaff规则：[A]=[T][G][C]碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理DNA纤维的X-线衍射图谱分析（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘；螺旋直径为2nm，形成大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove)相间。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（A=T;GC）相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。碱基互补配对（三）DNA双螺旋结构的多样性A型DNAB型DNAZ型DNA二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装（一）DNA的超螺旋结构超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反超螺旋的形式中心轴的盘绕同双螺旋两条链盘绕的方向相反，称为负超螺旋。负超螺旋能让DNA分子通过调整双螺旋本身的结构来减少这种张力。一般是减少每个碱基对的旋转，即放松两股链彼此的盘绕，所以把具有负超螺旋的DNA称为盘绕不足DNA。如果负超螺旋产生的张力较大，可能破坏局部的碱基配对，而使双螺旋局部解链。正超螺旋会使螺旋更加紧密，所以把正超螺旋称为过分盘绕DNA。几乎所有天然DNA都是负超螺旋类型。意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。（二）DNA在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。核小体的组成DNA：约200bp组蛋白：H1H2A，H2BH3H4染色体的包装方式三、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是储存、复制和传递遗传信息基础的物质基础。基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。四、RNA的结构RNA的种类、分布、功能核蛋白体RNA信使RNA转运RNA核内不均一RNA核内小RNA胞浆小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核蛋白体组分蛋白质合成模板转运氨基酸成熟mRNA的前体参与hnRNA的剪接、转运rRNA的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分核仁小RNA核蛋白体RNA信使RNA转运RNA核内不均一RNA核内小RNA胞浆小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核蛋白体组分蛋白质合成模板转运氨基酸成熟mRNA的前体参与hnRNA的剪接、转运rRNA的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分核仁小RNARNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G除了可以和C配对外，也可以和U配对。G-U配对形成的氢键较弱。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。（1）信使RNA的结构与功能目录hnRNA内含子(intron)mRNA*mRNA成熟过程外显子(exon)*mRNA结构特点1.大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。2.大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控帽子结构和多聚A尾的功能*mRNA的功能把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核细胞*tRNA的一级结构特点含10~20%稀有碱基3´末端为—CCA-OH5´末端大多数为G（2）转运RNA的结构与功能NNHNHNNOCH3CH3NNNHNNHCH2CHCCH3CH3NHNHOOHHHHNHNHSON,N二甲基鸟嘌呤N6-异戊烯腺嘌呤双氢尿嘧啶4-巯尿嘧啶稀有碱基*tRNA的二级结构——三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环额外环TΨC环氨基酸臂额外环*tRNA的三级结构——倒L形*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。*rRNA的结构（3）核糖体RNA的结构与功能*rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。*rRNA的种类（根据沉降系数）真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35%非编码RNA定义：指那些不被翻译成蛋白质的RNA分子。类型：snoRNA、siRNA、miRNA、snRNA、反义RNAsnoRNA:细胞核内核蛋白颗粒的组分，参与mRNA前体的剪接及成熟mRNA由核内向胞质中的转运，在RNA的转录后加工起重要作用。siRNA:一种含20-25个核苷酸的小分子RNA，激发与之互补的靶mRNA的沉默。miRNA:20个核苷酸的茎环结构RNA，与靶mRNA结合，使转录后的基因沉默。在一定条件下可逆释放，回复mRNA蛋白质翻译功能。反义RNA：可与特异的mRNA序列互补配对，阻断mRNA翻译，参与基因表达的调控。2.1.3核酸的理化性质1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用二、DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失DNA变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱目录增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。融解温度Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度。其大小与G+C含量成正比。三、DNA的复性与分子杂交DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链。核酸分子杂交(hybridization)分子杂交DNA-RNADNA-DNARNA-RNA目录核酸的杂交核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性检测待检样品中某些专一序列是基因芯片技术的基础目录基因芯片2.1.4常用的核酸体外合成技术（1）核酸的PCR合成技术聚合酶链反应（PCR）：一种在体外选择性的将DNA某个特定区域快速扩增的技术。原理：在微量模板DNA、四种dNTP、引物、聚合酶存在的条件下，通过模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火和引物延伸三个基本反应步骤。目录反应步骤•模板变性：94℃•模板与引物退火：54℃•引物延伸：72℃以脱氧核苷酸为原料，靶序列为模板，剪辑配对原则，得到一条新的DNA。30次循环，可将模板扩增几百万倍。（2）核酸的固相合成技术•单体：核苷亚磷酰胺原理：先将目标核酸链的3’端核苷固定在一个不溶性固相载体上，后沿3’-5’方向依次添加核苷酸至合成所需的长度，再将寡核苷酸链从固相载体上切下，并脱保护基。核酸的固相合成技术PGdR碱基O3’5’OH第一个核苷酸PGdR碱基O3