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离子交换层析介质的应用离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。1.离子交换层析的基本原理：离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。2.离子交换层析介质：离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+；Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pIpH的蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；等电点pIpH的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。3.离子交换层析介质的种类和性质：3.1离子交换剂的基质：离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成，苯乙烯系离子交换剂是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。苯乙烯系离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。以纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质。3.2离子交换剂的电荷基团：根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH范围，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的pH范围则较小，如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团，如磺酸甲基、磺酸乙基等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团和亚磷酸基团为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基或羧基，如羧甲基为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子小，弱酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子大。阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团，如季胺乙基为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子小，弱酸型离子交换剂对OH-离子的结合力比Cl-离子大。3.3交换容量：交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为对于很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小。同时pH也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（mmol/g或mmol/mL）来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HCl处理，使其平衡离子为H+。再用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用NaCl充分置换出H+，再用标准浓度的NaOH滴定生成的HCl，就可以计算出离子交换剂的交换容量；对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将H+充分置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗的碱量，就可以算出交换容量。阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示，一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。1.离子交换剂的选择在进行分离纯化时，要求层析柱具有高负载量、易于操作及使用寿命长等特点，其中分离介质是最主要的影响因素，因此，分离介质的选择尤为重要。1.1品种的选择：应根据被分离纯化目标产物所带电荷的种类、分子的大小、物理化学性质及所处的微环境等因素，选择适宜的离子交换层析介质。对于无机小分子而言，分离介质的选择相对容易，但对于生物大分子就必须考虑更多的因素。蛋白质等生物大分子是由多种氨基酸所组成的，在不同的pH条件下显示不同的电性，而生物大分子对最适宜的pH环境具有特定的要求，因此，必须首先了解目标蛋白的等电点及适宜的微环境，根据这些条件选择合适的离子交换剂种类。是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂，主要取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH范围为6~9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换剂进行分离。1.2骨架的选择：应根据目标产品的产量、要求达到的纯度及经济价值等因素，选择合适骨架（基质）的离子交换剂。通用型的聚苯乙烯离子交换树脂具有结构稳定、价格低廉、全交换容量高等特点，适用于如抗生素、有机酸、动物资源或植物资源的有效成分等一般生化制品的提取分离工艺。而对于要求分辨率高、制品纯度高的一些高附加值的基因工程产品，仍需使用纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的生化分离专用介质。纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。理想的分离介质应该不但易于吸附，还要易于洗脱，如果目标产物对于离子强度和pH值的变化不敏感，可以考虑采用高电荷密度的强酸性或强碱性的强型介质。如果对这些因素比较敏感，则应采用弱酸性或弱碱性的弱型介质。如果大分子物质被吸附后，结合比较牢固，往往难以洗脱，采用苛刻的条件又容易引起大分子的变性，则应选用功能基团密度低的介质。强酸性或强碱性的强型介质，适用的pH范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH下的分离，但由于电性较强，有时易使一些敏感的生物分子变性或失活。弱酸性或弱碱性的弱型介质，其选择性有较大的范围，且不易使蛋白质失活，故一般适用于分离蛋白质等大分子物质，但其适用的pH范围较窄。1.3粒径的选择：分离介质粒径的大小对离子交换层析柱的分辨率和流速有明显的影响。一般来说分离介质的粒径小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；粒径大则柱的流速较快，压降小，但分辨率低，负载量也较小。所以大颗粒的分离介质适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的分离介质适合于需要高分辨率的精细分离或产品的精制阶段。2.操作中注意事项2.1预处理：在离子交换剂的工业产品中，常含有少量的有机低聚物及一些无机杂质，在使用初期会逐渐溶解释放，影响目标产品的质量。因此，工业级离子交换剂在使用前必须进行预处理。通用型的离子交换树脂通常使用酸、碱进行处理，可采用1~2mol/L的盐酸及氢氧化钠溶液，以4~6倍树脂床体积交替进行处理，在酸及碱处理之间须用去离子水洗至中性。对于大孔型的树脂，还需要用乙醇、丙酮等有机溶剂进行处理，以除去