搜索
专家论著HCG分子结构与免疫定量分析上海第二医科大学瑞金医院卢湾分院南洋放免中心许叔祥教授HCG是妇女妊娠和滋养叶细胞疾病（良、恶性葡萄胎，绒毛膜上皮癌）等诊断、疗效随访，必不可少的检测指标，也是妇女生殖激素中测定最多的项目。HCG以往都使用放射免疫法（RIA）测定，自从九十年代开始，由于各种非放免标记免疫技术的发展和相应自动化仪器的诞生，逐渐替代了RIA方法。在临床应用中发现两大问题：（1）RIA测定的结果与现用非放免标记免疫（荧光、发光、时间分辨荧光等）不相符；（2）诊断妊娠的标准不一致，引起不少实验室人员和临床医生的费解和不适应。实际上这是一次HCG免疫分析技术的质的飞跃，必须深刻的理解和接受。本文拟以从HCG的分子结构和免疫定量分析技术的发展来讨论这一重要问题。1、HCG的分子结构和代谢绒毛膜促性腺激素（humanchorinicgonadotrophin,HCG）是胎盘合体滋养层细胞所分泌的一种糖蛋白激素，它的主要功能是维持黄体及降低母体淋巴细胞的活动，防止对胎儿的排斥反应。其分子量为39,000D，由237个氨基酸组成，其分子包括α,β两个链（亚单位），α链分子量为16000D，由92个氨基酸组成；β链分子量为23000D，由145个氨基酸组成。其中α链的组成与垂体激素、LH、FSH、TSH基本相同；而β链其羧酸端的最末28-30个氨基酸与垂体激素不同，为其所独有。从上可见在免疫分析中，倘若所用抗体与α链的位点有结合，便可能与如上垂体激素，特别是LH发生交叉结合而影响检测的正确性。反之如能选用专与β链特异末端位点结合的抗体，则可避免与垂体激素的交叉反应。HCG可因滋养层中巨噬细胞分泌的酶降解，使β链中第47、48位氨基酸间裂开，成为裂口HCG分子（nickedHCG，nHCG）,此酶也可使α,β链解离，成为游离片段（f-HCGα和f-HCGβ或f-nHCGβ),而HCG的最终代谢产物是β链的一个分子量仅为10KD的双链多肽核心片段(HCGβcf)。可见HCG在血和尿液中存在着不同形式的六种分子，但真正有生物活性的仅只一种，即无裂口的整分子HCG（IntactHCG），nHCG只有50%的活性，而其余分子完全没有活性。图1：HCG的分子及代谢正常妊娠时f-HCGβ不足1.0%,所以测定没有价值，而在滋养细胞疾病及唐氏症发生时，由于裂解酶的异常升高，使血液中nHCG、f-HCGβ、HCGβcf异常升高。从上可见，要观察妇女正常的生理妊娠必须测定有生理活性的HCG即整分子HCG，而测定代谢片段是没有意义的。f-HCGβ是没有生活理性的，其增高是病理的反应，甚至可看作是妇科肿瘤的一种标志物。2、HCG不同测定方法的比较免疫分析与生化分析的差异主要是因为用抗体来代替试剂与待测物质来进行反应，由于各自的方法不同，或虽用同一种方法，但选用的抗体不同，由于每个抗体对同一待测物分子的结合位点不同，故所测定的值不同，甚至差异很大。但若所结合的是同一分子，虽相互间绝对值不同，但相互间关系应该一致。为了比较同一方法不同药盒和同一厂商不同方法间的测定值，收集了HCG浓度不等的100份标本进行平行比对。⑴、不同厂商不同药盒的测定结果选用如下四种产品：①、DADE公司RXL-HX磁性非均相酶放大法②、DPC公司Immuliee酶放大化学发光法③、Bayer公司ACS-100直接化学发光法④、Beckman公司ACCESS酶放大化学发光法以RXL-HX为基础比较各方的测定值。表一、不同方法HCG测定结果的关系ImmulieeACS-100ACCESS斜率-0.952-0.9620.948截距-3.2303.7042.675相关系数0.9990.9960.998可见四个厂商,四种方法所测结果十分相近.⑵、同一厂商不同药盒的测定结果选用不同厂商的不同方法产品来比较方法学间的差异是毫无意义的，很难作出孰是孰非的结论。为了证明RIA、IRMA、和LIA（发光免疫分析）的差异，我们选购了同一DPC公司生产的RIA法HCG、IRMA法HCG、发光法（Immulite）HCG和发光法f-HCGβ,对如上标本同时测定。①、以ImmuliteHCG为基准，观察与各方法的关系表二、DPC不同产品测定结果的比较IRMARIAIRMAF-HCGβ斜率0.3870.409无相关截距105.5122.34相关系数0.8700.689可见化学发光法结果与IRMA相关尚可，但与RIA相关很差，而与F-HCGβ完全无相关。②、IRMA与RIA进行对比（以IRMA的基准）斜率为0.611，截距为101.3，相关系数为0.786，可见IRMA与RIA之间相关也很差。3、结果分析整分子HCG是具有生物活性的分子，而且非常稳定；而裂口HCG是不稳定的低活性分子。而游离的片段α或β及尿中排出的β核子是完全没有活性的。游离的β增高见于滋养叶细胞癌、唐氏症、睾丸癌。尿β核子的增高见于唐氏症、先兆子痫、卵巢癌、膀胱癌、宫颈癌及睾丸癌。所以测定不同物质有不同的用途和不同的意义。以往对HCG的测定都用RIA方法，采用的是多克隆抗体竞争法，实际其与HCG结合的位子并不详细。后来为了避免与LH的交叉，选用了与β链结合的多克隆抗体竞争法，见图二，其所用标记抗原、标准品都是β单链，所以测定的并不是整分子HCG，包括了nHCG、f-nHCGβ、HCGβcf等，又由于片段分子小于整分子，与抗体结合得可能更快、更多，所以测定的实际上是混合物，而事实上个体间、孕周间是不同的，一旦有滋养叶细胞病时影响更大。现在时代不同了，应用发光、荧光等自动化设备的检测已用二株单克隆抗体的夹心法来捕捉真正具有生物活性的整分子HCG（包括少量低活性的nHCG）而决不会测那些游离的无活性片段，见图二。这是免疫分析技术的一大突破，可见四种不同仪器所测结果十分一致。由于RIA与现行双抗夹心法所测的物质不同，所以正常值、临床诊断阈值也发生相应改变。孕期血和尿HCG的参考范围见表三、四。表三、孕期尿液HCG浓度的变化（WHO1STIRP/537）孕期（受孕后）激素浓度（IU/L）第三周＜50第四周＜400第七周5，000-90，000第十周40，000-230，000第十三周40，000-140，000第六个月8，000-100，000第九个月5，000-65，000表四、血清中HCG浓度参考范围男性和未怀孕妇女：＜5滋养层相关疾病：＞10，000孕期（受孕后）激素浓度（IU/L）第一周5—50第二周50-500第三周100-10，000第四周1，000-30，000第五周3,500-115，000第六-八周12，000-270，000第十二周15，000-220，000摘自《ClinicalLaboratoryReferenceTest》目前市场上销售的HCG命名十分紊乱如HCG，总HCG、HCGβ、βHCG、游离βHCG等等，其实际含义是不明确的，如βHCG是指IntactHCG还是nHCG、F-HCGβ、F-nHCGβ、HCGβcf片段，它们都有β免疫活性，而实际在正常妊娠中测这些片段是没有临床意义的。要测整分子具有活性的HCG分子必须使用双抗体夹心法，不能用多抗竞争法。并在标签上必须明确指出是测整分子HCG。若测游离片段，也必须用二株特异性的对β链单抗，采用夹心法才能真正测得f-HCGβ,用于滋养叶细胞肿瘤的检测。POCT（即时检验）是近年来临床检验中发展起来的一个分支，包含着很多新的技术，虽然目前应用还不太多，但这将是检验医学一次战略性的变革，国内著名学者扬振华、丛玉隆教授都预测在不久的将来POCT将占整个检验项目70-80%，它将在有效的提高临床诊断效率和降低总的医疗支出中发挥积极作用，它的重要性也将会被人们进一步的认识和接受。在这同时也要求POCT的自身质量、稳定性及与大型设备检测结果的一致性有进一步的提高。HCG检测是POCT在临床上应用最早、最广的一个项目。我们不能满足于最初的快速与阴/阳定性，因为HCG不仅是检测早孕，还可用于早期胚胎发育的监测，宫外孕诊断、及异常妊娠（良、恶性葡萄胎，绒毛癌）的诊断及疗效随访，均需具体测值，所以我们迫切希望实现定量。要定量不仅是分析技术和相应仪器的改进，使其呈色具有稳定的、宽量程的线性，其中更重要的是要国际接纳，回答“检测的到底是什么分子？”。我们高兴地看到上海奥普生物医药有限公司研发出检测整分子HCG的定量POCT系统（免疫渗滤反应卡和专用定量测定仪），这是一次理论的提高和技术的更新换代。（本文录自：中国医学检验杂志2004第二期28-31）人绒毛膜促性腺激素（HCG）金标法快速定量检测的临床意义女性受精的卵子移动到子宫腔内着床后，形成胚胎，在发育成为胎儿的过程中，孕妇胎盘绒毛膜滋养层合体细胞合成，产生大量的人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropinHCG）进入母体。这种激素（HCG）可通过孕妇的血液循环而排泄到尿中。当妊娠1-2周时血液和尿中的HCG水平即可迅速升高，第8-12周可达到高峰。直至孕期4个月降至中等水平，并一直维持到妊娠末期。HCG包括有α和β两个亚基，α亚基和促黄体激素（LH）、促滤泡激素（FSH）、促甲状腺生长激素（TSH）的α亚基相同，仅用多抗的免疫学方法测定时互相干扰，有较大的交叉反应。β亚基的羧端28-30氨基酸为HCG独有，故采用β亚基制备的特异性单克隆抗体测定血中HCG可提高特异性，降低交叉免疫反应。1、HCG定性与定量检测临床价值的分析比较提示人们:应改变观念，充分认识HCG定量检测的重要性妊娠的检测从雄蟾蜍等动物试验开始，到妊娠胶乳试验及金标早早孕试条的应用，均是定性试验。受当时技术条件的限制，以往需要放射免疫（RIA）法或其他复杂的方法才能定量检测HCG，于是形成了一般人的传统观念，即怀孕与否做个定性的妊娠试验即可。但是随着HCG检测技术的进步，可以在数分钟内简便地定量检测HCG，优生优育也需要了解胎儿发育的状况。自发性流产、宫外孕、滋养层细胞肿瘤发病的增高，也使临床上迫切需要HCG的定量检测，仅仅是妊娠试验阳性，对上述疾病无诊断意义。这是因为：⑴、定性的妊娠试验HCG含量25mIU/ml，即可显示阳性，而15000mIU/ml也报告阳性，同样是阳性，其HCG含量差600多倍，这么大的差异结合其妊娠期，临床上用于早期胚胎发育监测及许多妇产科疾病的鉴别诊断。⑵、各种病理状况如：宫外孕的诊断、先兆流产保胎的成功与否，滋养细胞源性肿瘤的诊断和疗效观察，妊娠残留物的检测以及作为肿瘤标志物的应用，单纯妊娠试验的阳性不能反映HCG绝对值不正常的过高或过低，对上述疾病的诊断不起作用。⑶、妊娠的不同时期，HCG的含量是不一样的。妊娠第二周HCG含量范围约在50-500mIU/ml，第三周100-10000mIU/ml，第四周1000-30000mIU/ml……HCG含量以此速度不断快速增长，直至12周后HCG不再增加，维持在一个较为平坦的高水平，直至分娩。妊娠不同的周数与其对应的HCG水平不正常的过低或过高，特别是HCG增长的速率过慢或过快均可反应可能存在的异常情况。这些HCG含量的变化，定性试验始终是阳性，只有定量检测才可反映这种含量的变化。因此，改变检测观念从单纯的定性妊娠试验，变为HCG的定量检测是何等的重要！而HCG的定量检测可有助于对上述疾病的动态观察和辅助诊断，便于明确诊断和有效治疗。⑷、在妊娠12周内的HCG水平的增长变化，不像人体其他激素那样的变化幅度很小，正常妊娠时HCG的增长速率是极快的。HCG的浓度每时每刻都在增加。胚胎发育正常时，在妊娠初期，HCG二次相隔48小时的定量检测，第二次增高幅度应约为第一次值的66％。也就是说第一次检测是1000mIU/ml的话，48小时后应为1660mIU/ml左右。也有作者提出HCG如果第一次检测后约过2.3-2.5天，HCG浓度较第一次翻一倍。妊娠时HCG浓度极快的增长速率特性，可通过定量检测来辅助区分正常妊娠和许多异常的病理情况。这些定性妊娠试验时做不到的。⑸、H