HPV检测方法

HPV检测方法进展筛查感染？还是高风险人群？第四军医大学第二附属医院妇产科杨艳红副教授宫颈癌筛查和预防实践指南HPV病毒的结构HPV病毒的检测方法病例分享1974年，ZurHausen提出HPV与宫颈癌发病有关的假设。1989年，KeertiShah发现99.7%的宫颈癌与HPV感染有关，证实宫颈癌与HPV感染有直接关系。1995年，WHO指出高危型HPV的持续性感染是宫颈癌的主要病因。2008年度诺贝尔生理学或医学奖获得者-德国科学家哈拉尔德·楚尔·豪森（HaraldzurHausen）HPV检测是筛查宫颈癌相关高级别病变的重要手段。HPV病毒与宫颈癌宫颈癌筛查和预防实践指南2016年1月，美国妇产科医师学会发布了宫颈癌筛查和预防实践指南。推荐中的改变包括：单一使用HPV测试筛查的角色。年轻女性如果出现HPV感染，而几乎所有人都可以在1-2年内依靠免疫系统清除病毒而不发生瘤变，更早的进行筛查可能会增加患者的焦虑、患病率和花费，并导致过度随诊。宫颈癌筛查和预防实践指南21-29岁女性应行单独细胞学检查，每3年筛查1次，不必每年行宫颈癌的筛查。25岁以上女性宫颈癌的初筛，HPV初筛可以代替当前细胞学检查。30岁以下女性不必行联合筛查。30-65岁女性推荐每5年行细胞学和HPV联合检查，每3年单独行细胞学检查也是可行的，不必每年筛查。对于既往筛查充分阴性且没有CIN2或更高级别病变的患者，65岁以后应停止筛查。宫颈癌筛查和预防实践指南所谓既往筛查结果充分阴性被定义为，在过去10年间，连续3次细胞学阴性，或2次联合筛查阴性，最近的一次检查在5年之内。在CIN2、CIN3和AIS病史的女性，应该在CIN2、CIN3和AIS自然消退或妥善治疗后持续筛查20年，即使超过65岁。宫颈癌筛查和预防实践指南关于HPV病毒E1、E2、E4和E5负责病毒复制E6、E7为两种致癌蛋白编码，它们是高危型HPV导致宫颈癌的主要原因L1、L2为两种病毒外壳蛋白编码，在预防HPV的疫苗中使用了L1，大部分HPV检测方法检测L1区逆转录区域包括控制病毒基因组复制的基因序列HPV基因组结构HPVDNA和人类DNA发生整合宫颈细胞DNA游离HPVDNAHPV病毒感染后的两个阶段初始HPV感染（潜伏期）持续HPV感染（活跃期）E6、E7mRNAE6、E7癌蛋白E6/E7mRNA低表达不导致细胞高级别病变可被清除，一过性感染高水平的E6/E7mRNA表达导致细胞高级别病变发展为持续性感染E6/E7mRNA与高级别宫颈疾病更相关Doorbar.ClinicalScience2006.110(5):525-41消退正常上皮细胞HPV感染上皮细胞CIN1orLSILCIN2orHSILCIN3+orHSIL宫颈癌月年十年计HPVE6/E7mRNA水平HPVDNA水平E6致癌基因过度表达抵消了p53的多种抑癌作用，允许出现DNA损伤的细胞能够继续分裂；E7与pRB结合导致蛋白降解和与pRb结合的E2F转录因子的释放。这些游离的E2F转录因子会激活许多参与在G1/S期调控点的细胞周期调控基因。这种联合效应使得存在未修复DNA损伤的细胞可以无限增殖并且保持过度增殖状态。HPV病毒感染后的两个阶段HPV病毒感染后的两个阶段E6/E7致癌蛋白在细胞转化中的功能宫颈癌最理想的筛查策略筛查益处最大化：需要识别可能发展为浸润癌的宫颈癌前病变潜在风险最小化：需要避免对一过性HPV病毒感染及其导致的良性病变的探查和不必要的治疗，甚至过度治疗。20HPV病毒检测技术发展趋势宫颈癌筛查技术发展趋势2000s第一代2010s第二代HPVDNA检测•高灵敏度•特异性一般HRHPV检测HPVE6/E7mRNA检测•高灵敏度•改善的特异性HPV病毒的检测方法广东凯普23荧光分型6管反应，一次处理16个样本江苏硕世21荧光分型8管反应，一次处理14个样本上海之江13荧光分型8管反应，一次处理14个样本其它（凯杰、达安等）现有的国产HPV检测方法原癌基因1HybridCapture2High-RiskHPVDNATest®packageinsert#L00665Rev.220072.cobasHPVTestUSPackageInsert#05641268001-0NRev1.020133.AbbottRealTimeHighRiskHPVPackageInsert#2N0949-2028/R3B2N090,Mar.20104.APTIMAHPVAssaypackageinsert#502170RevA2011HPVDNAL2L1LCRE6E7E1E2E5E4HybridCapture2®1RocheHPV引物/探针L2L1LCRE6E7E1E2E5E4cobas®HPV2AbbottRealTimeHighRiskHPV3L2L1LCRE6E7E1E2E5E4APTIMAHPV探针APTIMA®HPV4HPVDNAHPVmRNAhc2探针HPV病毒检测的设计策略进口HPV病毒的检测方法环状HPVDNA以线状和人基因组发生整合HumangDNAL2L1LCRE6E7E1E2HPVDNAHumangDNALCRE6E1E2整合后L1丢失E7HumangDNAHumangDNA12浸润性宫颈癌发生L1区的丢失，会造成以L1区为目标检测的HPVDNA出现假阴性结果HPV病毒整合后L1区丢失HC2（HybridCapture2）FDA第一个认证的HPV检测技术（1999年）对13种高危型别HPV定性和半定量测定检测高度病变的（HSIL）的敏感度88-100%阴性预测值高达99%通过大量的临床试验，证明HPV-DNA检测对CIN2+的诊断有很高的敏感性和较高的特异性，从而确定HPV-DNA检测可用于宫颈癌筛查HC2已经成为各种HPV检测技术的金标准FDA认证的三种HPV检测技术2009年CervistaHPV-Invader酶切信号放大法Cobas4800-实时荧光定量PCR技术2012年Aptima-RNA逆转录扩增法CervistaHPV-DNA检测在等温反应，有Cleavase酶特异性识别并切割分子结构，通过分子杂交和化学信号放大，从而直接检测特定的HPV-DNA核苷酸序列。在报告高危阳性的同时，14种型别的分组检测，其中A9组对亚洲人群可能有一定意义。TCT和Cervista检测一次取样HPV组亚组备注A5A651、56、66A718、39、45、59、6818型及类似型A916、31、33、35、52、5816型及类似型，亚洲感染Cobas4800HPV-DNA检测实时聚合酶链式反应（PCR）、扩增和检测技术，需要有严格的PCR实验室认证。在报告14型别的高危阳性的同时，进行16和18分型。2014年4月美国FDA批准Cobas4800HPV-DNA检测技术可用于25岁以上女性宫颈癌的初筛，对于16和18型阳性推荐直接进行阴道镜。AptimaHPV-mRNA检测FDA第一个认证的HPVmRNA检测技术。检测14型HPV高危亚型合成致病E6/E7蛋白的mRNA，将mRNA进行反转录扩增，再结合探针读取信号。由于检测mRNA，可提高检测的特异性。AptimaHPV检测----E6/E7mRNA两种检测试剂盒：AptimaHPV（14种高危亚型）和AptimaHPV16,18/45分型检测检测HPV致癌基因E6、E7的mRNA与第一代HPVDNA检测试剂相比：相同的临床灵敏度和阴性预测值，更好的临床特异性和阳性预测值减少对一过性HPV感染的检出，减少不必要的阴道镜转诊，减少病人不必要的心理压力关注“病变”，而非“感染”HPVE6/E7mRNA比较HPVDNAHPV感染宫颈癌前病变HPVDNA阳性HPVE6、E7mRNA阳性有效减少对一过性HPV病毒感染的检出(20-40%)Quest全球最大第三方实验室推荐AptimaHPV检测符合美国2012ACS,ASCCP,ASCO,ACOG和USPSTF的宫颈癌筛查指南与DNA试剂相比，能提供相同的敏感性和更好的特异性FDA批准病例分享患者，女性，49岁。山西省万荣县农民。2013年10月因骑自行车被四轮小汽车撞倒，车祸后尾骨骨折保守治疗，导致肛门疼痛不适，多次在当地医院骨科就诊疼痛不缓解。2014年8月25日，在运城市妇幼保健院就诊，宫颈液基细胞学检查：非典型腺细胞。超声检查提示：宫颈内可见大小约2.0cmX1.4cm略高回声团块，周边及内部可见丰富血流信号，提示宫颈异常回声。9月5日宫颈活检：慢性宫颈炎伴鳞状上皮瘤样增生，局灶见少许破碎的鳞状上皮CINIII级。病例分享2014年9月19日来我院门诊就诊：妇科检查：宫颈肥大，光滑，可见多个纳氏腺体囊肿。处理：会诊病理切片、阴道镜、HPV检测及盆腔MRI。阴道镜：慢性宫颈炎。2014年9月22日我院MRI报告：子宫颈部异常信号改变，考虑宫颈癌（IIb期），并周围多发潴留囊肿形成。我院会诊病理切片：慢性宫颈炎伴鳞状上皮增生，局部见少许散在鳞状上皮，考虑CINII-III级。2014年9月24日第一次入院，高危型HPV-16阳性。我院超声：子宫内膜0.66cm，宫颈前后径3.8cm，宫颈见数个大小不等的液性暗区；宫颈处见1.4cmX1.0cm稍强回声，形态欠规则，边界欠清楚，周边见点条状血流信号。病例分享入院处理：分段诊刮+宫颈锥切。2014年9月28日分段诊刮。病理切片：肉眼见灰黄色不规则组织一堆，总体积0.6cmX0.3cmX0.2cm；另见灰黄色不规则组织一堆，总体积1cmX1cmX0.3cm。病理诊断：（宫颈管和宫腔）部分细胞中-重度不典型增生并局部提示为少数细胞癌变。2014年9月28日宫颈Leep手术，病理切片：肉眼所见宫颈：灰白灰黄色不规则组织三块，2.5cmX2cmX1cm；切缘：灰白灰黄色不规则组织三块，1.8cmX1cmX0.6cm。病理诊断：（宫颈）慢性宫颈炎伴鳞状上皮增生，局部呈CINI级。切缘：慢性宫颈炎。病例分享2014年10月25日锥切后1月要求手术再次入院。2014年10月29日宫颈癌根治术，术后剖开子宫肉眼可见宫颈管11点近宫颈内口处有1.3cmX1.2cm的溃烂面。病理诊断：全子宫、双附件及双侧盆腔淋巴结切除标本。1.宫颈溃疡型恶性肿瘤，符合鳞状细胞癌II-III级，癌组织浸润至1/5层；2.子宫内膜单纯性，子宫体未查见癌组织；3.双侧输卵管及卵巢均未查见癌组织；4.阴道切缘、双侧圆韧带及阔韧带切缘未查见癌组织；5.盆腔淋巴结左侧（0/7）及右侧（0/17）均未查见癌组织。宫颈癌筛查技术发展趋势细胞学检查筛查技术发展趋势1940s第一代1990s第二代液基细胞学(LBC)•改善的灵敏度•高特异性2000s第一代2010s第二代HPVDNA检测•高灵敏度•特异性一般HRHPV检测HPVE6/E7mRNA检测•高灵敏度•改善的特异性宫颈涂片(Pap)•灵敏度一般•高特异性细胞学作为初筛的意义和难点1941年确定了在宫颈癌筛查中的诊断价值，60年间细胞学对宫颈癌的筛查起到了不可磨灭的作用，至今有不少国家仍采用细胞学初筛。1951年我国协和杨大望教授引进细胞学。70年代在全国进行的十省市地区61万人群普查中，经细胞学发现癌和高度可疑癌，并经活检确诊达全部癌症61%。液基细胞学制片技术的改进与传统巴氏涂片相比，提高了对CIN及宫颈癌诊断的敏感性及特异性。细胞学在检测CIN2或更高级别病变时的敏感性较低；细胞学ASC-US对于癌前病变不具有非常好的特异性；实验室间结果差异大。临床医师取材、细胞玻片制备、染色技术的不稳定。难点：我国缺乏规范化细胞病理学学医师培养和准入制度，极度缺乏专业细胞病理学医师。缺乏一致性：细胞学正常由资深的细胞学专家复核，一致符合率78%，初始诊断为HSIL的只有47%。（katki，2013）宫颈癌漏诊：965360例30岁