4 GC-MS数据处理和定性定量分析

GC/MS数据处理和定性定量分析赛默飞世尔科技应用工程师：任安书GC/MS数据系统•GC／MS联用获得的数据量非常大，信息也非常丰富，如果数据处理不当，可能丢失许多宝贵的信息。一个样品如果GC／MS得到的TIC图中有100个可鉴别的色谱峰。却可能会有上千张质谱图，因为每个色谱峰至少有3～5次扫描，色谱峰间隔也有若干次扫描。每张质谱图都有可利用的信息GC/MS数据系统•各种近代分析仪器都配备了计算机和相应的应用软件，通称为仪器的数据系统(也有称化学工作站)。GC／MS联用仪器的数据系统包括硬件和软件两个部分•应具备以下功能：①控制仪器运行，包括设置气相色谱、质谱的运行参数，实时显示运行状态，如真空，压力、温度、电压参数及所运行的方法等；②采集、处理、简化、储存数据，并实时监测数据采集过程；③数据再现和处理，谱图处理、定性、定量分析、结果输出、数据传输等。数据系统的结构和功能对仪器性能的发挥及仪器操作的灵活性至关重要GC/MS数据系统•目前多数仪器数据系统的硬件，包括计算机主机及显示器、键盘、打印机等基本的外围设备，一般都是通用的PC机，但是配置不同，性能差别也不小•还有一个很重要的部件，即任何计算机和GC／MS仪器连接，也需要有一个“接口”，是由模数／数模转换器(A／D、D／A)、多路切换开关、实时钟还有微处理器等组成的接口电路板，放在电子部件的机箱内。它不是通用部件，不同生产厂家、不同类型仪器的接口板结构性能都不相同。它的功是将质谱检测器接收的离子流的电压信号通过A／D转换成数字信号，经微处理器采集、简化处理并储存在计算机中，这就是通常获得的谱图的原始数据文件•另外，通过D／A转换将操作员从计算机键盘输入的各种参数通过A／D转换传送到相关的电路控制器，控制仪器运行，同时在显示屏上显示仪器运行状态。它关系到数据的采集、传输速率和数据的质量GC/MS数据系统•数据系统的软件包括运行仪器的操作系统和各种应用程序，还有各种用途的质谱数据库。不同生产厂家、不同类型仪器的操作系统也不相同•但近年来有的厂家将自家生产的不同类型仪器的操作系统逐渐统一规范化，除了控制仪器运行和数据采集功能不通用外，数据处理的功能都是通用的，并且可联网，做到资源共享GC/MS数据系统•值得注意的是，计算机辅助质谱解析通用软件的发展，过去质谱数据库虽然是通用的，但是各个厂家数据系统采集的质谱数据格式不同，谱库检索的系统也不相同•近年来质谱数据有了多种转换格式，一些厂家的应用软件还提供了不同质谱数据格式的转换功能，NIST的谱库检索系统已被普遍采用，最新版的NIST、软件，增加了许多应用程序，除分子量、同位素丰度、元素组成计算等基本功能外，还有谱图解析、自动鉴别质谱数据、分离GC共流出色谱峰等应用软件一、质谱图的提取•质谱库检索和谱图解析都需要获得好的质谱图。质谱图的提取不仅要保证谱图的质量，还要不丢失可鉴定的组分，包括共流出组分的分离。背景扣除没有固定的要求•例如：是取色谱峰顶对应的一张质谱图还是几张质谱图平均，需不需要扣除背景，是扣除前面还是后面的谱图等。主要的是根据出峰情况，结合样品信息和实验条件进行判断。知识和经验的积累是必需的。二、质量色谱法的应用•只要有总离子流色谱图，就可以提取扫描质量范围内任何质量的离子流图，即质量色谱图。质量色谱图可以提供许多信息，应用它可解决许多问题，如色谱峰纯度检查、追踪目标化合物、确定同系物的碳数分布范围、进行准确定量等，所以被称为质量色谱法•(1)色谱峰纯度检查和准确定量上面的例子已经说明质量色谱法可以帮助鉴别共流出组分，做色谱峰纯度检查。又因为质量色谱将两个组分完全分开了，而色谱峰则未完全分开，所以用质量色谱峰面积进行定量比用色谱峰面积定量要准确得多二、质量色谱法的应用•(2)目标化合物追踪•邻苯二甲酸酯类是常见的增缩剂，在分析试验室中几乎无所不在，各种塑料包装、塑料瓶盖、样品预处理用的一些试剂、硅胶、树脂等都含有此类化合物•它们的沸点较高，容易残留在色谱柱中，柱温升高到200℃以上就会流出。往往在GC／MS分析前做空白试验时，检查是否有这类化合物残留，可采用质量色谱追踪，如果有这类化合物很容易检查出来由邻苯二甲酸丁酯和邻苯二甲酸辛酯的质谱图(图1—96)可知，它们有非常强的特征离子m／z149。在空白试验或考察GC／MS联用本底时，采集数据过程中用m／z149离子流图实时追踪，或从数据采集后得到的TIC图中提取m／z149质量色谱图，都能很快判断它们是否存在二、质量色谱法的应用•进样品前空白试验的实例•色谱条件：起始温度60℃，停留5min，以6℃／min升温至280℃，停留10min。目的是察看色谱柱流失本底和高温段的基线漂移情况•这里截取30min后的一段总离子流和m／z207、m／z149的离子流图。35min后基线开始上升，固定相本底中m／z207增高。•温度达到240℃，m／z149质量色谱显示有一个峰(2115号)，40min后温度到280℃，基线上升,m／z149质量色谱也显示有一个峰(249号)•将这两次扫描的质谱图和检索结果标准谱图比较，虽然分子离子无法确认，但凭经验可以认定是邻苯二甲酸类化合物。它们易残留在柱子中，而且一般要在较高温度下才能流出二、质量色谱法的应用三、GC/MS定性分析•充分发挥GC／MS联用技术的优势，分离是定性的关键。质谱定性专一性好的前提是得到正确的质谱谱图。同一样品，分离条件不同，可能鉴定出上百个成分，也可能只鉴定出几十个成分。三、GC/MS定性分析•定性不能只依靠质谱谱库检索。分离不好得到的质谱图不可靠，不仅检索匹配率可信度低，对质谱图进行解析也有困难。色谱的保留时间以及与样品相关的一系列信息都是定性的重要依据。实际上未知化合物鉴定有两种不同的含义：一是待测样品中已知结构化合物的鉴定(目标化合物或可疑化合物)；另一种是待测样品中是否发现新的未知结构化合物。后者是一个较大的分析课题，需要有其它辅助方法鉴定，最终还需合成验证GC／MS定性分析类型及相关分析技术分析对象要求分析方法目标化合物确认1．与标准化合物保留时间对比2．与标准化合物谱图对比(几个离子匹配)可疑化合物确认1．标准化合物保留时间对比2．与标准化合物谱图对比(所有离子匹配)未知化合物解释1．测定分子量2．测定元素组成3．阐明结构657/2002/EC对质谱定性的要求全扫描：当用单级质谱记录全扫描图谱时，至少要有四种离子的相对丰度大于等于基峰的10%。如果分子离子峰在参考图谱中的相对丰度≥10%，则必须包括在内。选择离子监测质谱方法时要求:96/23/EC指令附录IA组4识别点96/23/EC指令附录IB组3识别点657/2002/EC对质谱定性的要求对质谱确证方法的要求对于每个诊断离子，信噪比3:1测定至少一对离子丰度比相对离子丰度最大容许偏差不能超过下表相对丰度（%基峰）EI-GC-MS（相对）CI-GC-MS、GC-MSnLC-MS、LC-MSn（相对）50%±10%±20%20%到50%±15%±25%10%到20%±20%±30%≤10%±50%±50%6.对质谱确证方法的要求对于每个诊断离子，信噪比3:1测定至少一对离子丰度比相对离子丰度最大容许偏差不能超过下表(三)对残留检测标准操作程序（SOP）编写作业指导书的基本要求相对丰度（%基峰）EI-GC-MS（相对）CI-GC-MS、GC-MSnLC-MS、LC-MSn（相对）50%±10%±20%20%到50%±15%±25%10%到20%±20%±30%≤10%±50%±50%三、GC/MS定量分析•有一种说法，认为色谱可以很好地定量，而GC／MS联用方法只适合于定性•实际上，这是一种误解。GC／MS联用技术不但可以定量，有时比色谱的其它检测器更具有优势。例如，其它色谱检测器均要求色谱峰完全分离才可以正确定量，而GC／MS联用技术可以在色谱峰不完全分离的情况下，用质量色谱法或选择离子检测，对其中的化合物分别定量。图中是色谱峰未分开(虚线)的两个化合物，但是并不影响它们分别用各自的特征质量离子m／z230、m／z244的峰面积定量。尤其用同位素标记化合物做内标进行定量分析更是GC／MS联用技术的独到之处。三、GC/MS定量分析•GC／MS联用技术定量分析的特点是先定性，后定量•对于一个化合物，首先根据其保留时间和质谱图特征离子鉴定，确认它是目标化合物之后再进行定量，因而避免假阳性检出。其次，GC／MS联用定量一般不用总离子流色谱图，而是用特征离子的离子流图。因为离子流图相对稳定而且不受干扰，定量结果更可靠。(一)定量分析基础•定量分析就是要确定待测样品中各组分或某一组分的准确含量。无论采用什么仪器，都是在一定条件下，根据检测器的响应因子与待测化合物含量的函数关系计算出目标化合物的含量•GC／MS联用分析，化合物特征质量离子的峰面积(或峰高)与相应待测组分的含量成正比•如何得到待测化合物的响应因子是定量分析的关键(一)定量分析基础•响应因子的测定需要标准样品，在实际工作中，纯化合物标准样品的获得和保存是定量分析的一个难题。尤其是有机化合物种类繁多，有的化合物不稳定，易挥发，易降解，不易保存•标准样品配制首先应该准确地配制一个母液。可以是单标(只含一个待测组分)，也可以是混合标(含数个待测组分)。每个组分的含量需准确，并且该含量高于待测样品的含量。然后再将配制的母液逐级稀释，最后一级的含量应低于待测样品的含量•如果需要加入内标，则在每一级稀释后的标准样品以及未知样品中加入等量的内标化合物(一)定量分析基础•定量结果的数据表达形式应该是取决于定量分析的方法•在GC／MS联用分析中，常见的一种定量结果报告是用TIC峰面积归一给出的相对百分含量。•这种定量结果虽有一些用处但不是严格的定量分析结果。因为这是将所有化合物的响应因子当作一样，而实际各种化合物的响应因子并不相同，即使是同系物亦会有很大区差别•还有一种情况是用浓度给出的定量结果，因为标准样品不够，只用了一个和几个标准样品的响应值代替所有待测化合物响应值。这种定量分析结果也是不严格的，因此都应作出必要的说明，以免误解(一)定量分析基础•GC／MS和GC／MS／MS联用方法常被作为定量检测的最终确证方法。因此质量保证／质量控制(QA／QC)是定量分析不可缺少的重要环节(二)定量方法•GC／MS联用分析常用的定量方法和色谱一样，有归一化法、外标法、内标法等。各有其优缺点和使用范围，不适当的运用必然造成较大的误差。•根据不同要求正确选择定量方法十分重要。定量方法中响应值的计算可以用峰高法也可以用峰面积法，要看在线性范围内哪一个测量的准确性和重复性更好。(二)定量方法•1．归一化方法•将样品中所有组分含量之和作为100，计算各个组分的相对百分含量，称为归一化法。计算公式：••式中Wi——组分i含量；•Ai——组分i的峰面积(或峰高)；•fi——组分i的质量校正因子。•当fi为体积校正因子或摩尔校正因子时，结果分别为体积分数或摩尔•分数。(二)定量方法•归一化方法的主要问题是校正因子的测定不容易，所以在GC／MS联用中，对于校正因子接近的一些化合物，往往直接用峰面积归一法计算，得到的是各组分峰面积的百分比。这也能有个定量的概念，因而有其实用意义•但是应注意，对于校正因子相差甚远的一些化合物，要慎重。还有，并不是待测样品的所有组分都能从色谱柱流出，或得到足够的信号强度，这会带来误差(二)定量方法•2．外标标准曲线方法•用标准样品配制不同浓度的标样，在与待测样品完全相同的操作条件下，•测得标样中各化合物的峰面积或峰高，得到响应因子：••式中wi——待测化合物标样含量；•Ai——待测化合物标样峰面积(或峰高)。(二)定量方法•不同浓度测得结果绘制工作曲线，标准工作曲线的斜率即是绝对校正因子。•待测化合物含量可从标准曲线直接查得，也可由下式计算：•Pi=fiAi(二)定量方法•3．内标标准曲线方法•外标法存在一定缺点，限于每次的分析条件从样品处理到测试都会产生误差。为了克服不