HILIC亲水相互作用色谱陶佳颐2复杂混合成分如何能将强极性和亲水性的成分分离?分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模式------反相液相色谱(RPLC)工作原理:依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用缺点:对强极性化合物的保留很弱,甚至不保留(小分子的极性官能团与流动相形成偶极矩作用,即溶剂化;与非极性的固定相没有这种作用,小分子停留在流动相中无法被固定相保留),因此强极性化合物在RPLC上不能得到很好的分离。可选:离子交换色谱法(IEC)、正相色谱法(NPLC)和亲水作用色谱法(HILIC)。它们可以作为RPLC的补充用于强极性化合物的分离。HILIC3背景介绍HILIC,HydrophilicInteractionLiquidChromatography,亲水相互作用色谱,1990年AndrewAlpert命名HILIC作为一种分离极性化合物的液相色谱模式,与正相色谱类似,在HILIC模式下化合物的保留时间随化合物极性的增强而增加。HILIC的主要特征:①亲水性的固定相②流动相含高比例的有机溶剂的含水溶剂(通常是乙腈,其中水是强洗脱溶剂)③和有机溶剂相容性较好的挥发性的缓冲盐,如乙酸铵、甲酸铵和碳酸铵等早在1970年代,HILIC的概念提出之前,Linden等就使用氨基硅胶作为固定相,以含75%乙腈的水溶液作为流动相用于糖的分离分析。这种分离技术是典型的HILIC模式,也是最早的关于HILIC的报道,虽然其中并未涉及HILIC的定义。AlpertAJ.JChromatogr,1990,499:177LindenJC,LawheadCL.JChromatogr,1975,105(1):1254背景介绍优点:①HILIC与NPLC的保留方式相似,但由于HILIC的流动相是含水有机溶剂,就避免了NPLC出现的水溶性物质不溶于流动相的问题②HILIC采用强极性固定相,以高比例有机相/低比例水相为流动相,这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱(ESI-MS)的灵敏度,而NPLC和IEC都无法做到。③NPLC样品峰易前沿或拖尾,保留时间随进样量漂移,流动相中微量水可改变样品的保留。HILIC柱效和峰对称性与RPLC相似5背景介绍HILIC的分离机制HILIC的分离机理在目前还存在着争议,主要包括以下三个方面:(1)分配机理:亲水性固定相固定了一层含水层(2)离子交换(3)偶极-偶极相互作用更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应,很难将其区分开来。6背景介绍HILIC影响保留的主要因素普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响,如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。影响保留行为的最主要因素:流动相中有机相的比例,例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。溶剂洗脱能力由弱到强为:四氢呋喃丙酮乙腈异丙醇乙醇甲醇水流动相中水是最强的洗脱溶剂。常用:乙腈-水为流动相,其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。另外,在不同柱温下,不同样品在不同固定相上的保留行为变化的趋势不一致;不同种类的缓冲盐和浓度对样品在色谱柱上的保留影响也不同,目前还没有统一的规律。7背景介绍如图1所示,将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替,随着流动相极性的减小,待测物在柱上的保留就会增强。Figure1.HILICretentionasafunctionofpolarmodifier.100mmlengthACQUITYUPLCBEHHILICcolumn.Peaks:1=methacrylicacid,2=cytosine,3=nortriptyline,4=nicotinicacid.8背景介绍HILIC与RP-HPLC的比较RPLC:对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱,通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留。高比例的水相会导致固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。HILIC:正好可以解决这些问题,提供了一种与传统RPLC互补的保留方式,能够使在RPLC上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留。研究样品在HIILC/RPLC保留的正交性Figure.Relativeorderofelutionofaminoacidsfromvariouscolumns.Tielinesconnectthesameaminoacid.PolyhydroxyethylAandPolysulfoethylA:Columns,20064.6mm;mobilephase(isocratic),10mMTEAP(pH2.8)containing80%v/vCH3CN.RP-HPLC:LinearABgradientfromwatertoCH3CN(0.1%TFAineach).SCX:StepgradientofincreasingsaltandpH.AdaptedfromAlpert,1990[13]withpermission.GilarM,OlivovaP,DalyAE,eta1.AnalChem,2005,77(19):6426.WangY,YangJ,LuX,eta1.ChineseChemLet,2007,18:565.9HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相反:极性较小的物质先出峰极性较大的物质后出峰如图所示:Figure.ComparisonofESI+MSresponseusingHILICandRPconditions.SIRchannelsofacetylcholine(m/z146.2)andcholine(m/z103.9);Columns:100mm×2.1mm,1.7μm(A)ACQUITYUPLCBEHC18(B)ACQUITYUPLCBEHHILIC.Peaks:1=acetylcholine,2=choline10固定相HILIC固定相的主要特征:固定相表面是与水有很好的亲和性的强极性基团,如氨基、羟基、酰胺基等。早期的亲水作用色谱分离材料主要是原有的正相色谱固定相,如硅胶、氨基键合硅胶、二醇基键合硅胶等。近年来,专门用于亲水作用色谱的分离材料也已出现,其主要是将含酰胺基、羟基、两性离子等强极性基团的分子键合到硅胶上作为HILIC分离材料。虽然按照Alpert提出的观点,亲水色谱的保留主要是依靠溶质在固定相表面吸附的“富水层”与流动相中的分配机理,但是由于溶质与固定相直接相互作用的存在,不同固定相的保留性质表现出较大的差异。11固定相一、传统的NPLC固定相直接用于HILICNPLC使用极性固定相和非极性流动相,依靠质分子在极性固定相表面的吸附实现分离。NPLC使用的极性固定相主要有纯硅胶、氨基键合相、氰基键合相和二醇基键合相等。这些固定相具有较强的极性和亲水性,都能直接用于HILIC。失活:10%StructuresoftheNPLCstationaryphasesusedinHILICa.silica;b.amino;c.cyano;d.diol.12固定相一、传统的NPLC固定相直接用于HILIC1、非衍生化纯硅胶固定相非衍生化纯硅胶表面的硅羟基具有很好的极性和亲水性,可以直接用作HILIC固定相在HILIC模式下对强极性化合物(特别是碱性化合物)具有一定的分离选择性。硅羟基的酸性(pka:1.5-10)还使硅胶固定相表现出一定的离子交换作用(在硅胶固定相上,极性的碱性化合物与带负电荷的硅羟基进行弱的阳离子交换)。Naidong,W.,J.Chromatogr.B,2003,796,209–224.13固定相一、传统的NPLC固定相直接用于HILIC1、非衍生化纯硅胶固定相缺陷:①寿命短:由于缺乏修饰层的保护,纯硅胶固定相在HILIC模式下的使用寿命较短,一般只能进样500次左右。近年来,Waters公司提出了有机/无机杂化硅胶的概念并推出了系列色谱柱,乙基桥杂化硅胶被应用于HILIC,其使用寿命比纯硅胶柱有了很大提高。②保留时间和重现性不理想:由于硅胶表面没有修饰层,因而硅胶的表面吸附活性、表面结构不均匀性和硅羟基的酸性使色谱峰形和分离重复性产生一定的问题。有机/无机杂化硅胶由于有机杂化基团的存在,其表面疏水性增加导致该固定相对强极性化合物的保留较弱,需要使用甲醇或乙醇取代水作为流动相以延长溶质的保留时间。总体来讲,硅胶和杂化硅胶固定相用于HILIC模式时,溶质保留时间较短,分离重复性也不是十分理想,适用范围有限。14固定相一、传统的NPLC固定相直接用于HILIC2、氨基键合相氨基键合相表现出典型的亲水色谱特性,对糖、有机酸、核苷等强极性化合物表现出很好的分离选择性。由于氨基具有弱碱性,在色谱分离过程中表现出一定的离子交换性质,尤其是分离酸性化合物时表现较明显。流动相的pH值和盐浓度对溶质的保留时间有影响也证实了氨基固定相用于HILIC分离时阴离子交换机理的存在。阴离子交换机理的存在对于提高固定相的选择性有一定的积极意义缺点:酸性化合物保留时间过长、峰形拖尾等问题。15固定相一、传统的NPLC固定相直接用于HILIC3、二醇基键合相和氰基键合相但同样由于键合相亲水性不足,存在着溶质保留时间较短的问题。传统的正相色谱固定相虽然可直接用于HILIC模式,但是在亲水性、选择性、重复性和使用寿命方面存在很多问题,其应用范围有限,不是理想的HILIC固定相。16固定相二、专为HILIC设计的固定相的发展由于HILIC模式的快速发展和强极性化合物分离需求的增强,专为HILIC设计的固定相得到了越来越多的关注和应用,并且已经有多种类型的专门用于HILIC的固定相实现了商品化。固定相的种类:根据键合相的化学结构进行分类,分为酰胺型、多元醇羟基型和两性离子型等。这几类基团具有很好的亲水性,十分适合作为亲水色谱的固定相,而且在一定程度上可以解决传统正相固定相用于HILIC所存在的问题。值得注意的是,使用不同合成方法制备的HILIC固定相,其极性功能基团的连接方式和空间排布不同,得到的HILIC固定相的表面化学结构和分离性能会有很大区别。17固定相二、专为HILIC设计的固定相的发展1、酰胺固定相酰胺基团有很好的亲水性和稳定性,而且是电中性基团。因此,酰胺固定相十分适合作为HILIC固定相,可以避免氨基固定相的使用寿命短、分离重复性差和色谱峰形不佳等问题出现。TSKgelAmide280固定相应用较为广泛,其在HILIC模式下用于分离核苷、核苷酸、肽、糖、糖醇和有机酸等亲水化合物,取得了很好的分离效果。YoshidaT.JBiochemBiophysMethods,2004,60(3):265KarlssonG,WingeS,SandbergH.JChromatogrA,2005,1092(2):24618固定相二、专为HILIC设计的固定相的发展2、醇羟基固定相优点:①具有很好的极性和亲水性;②不会发生电离,反应活性也较低;③很好的稳定性。十分适合作为亲水色谱固定相与正相色谱中常用的二元醇羟基固定相相比,多元醇羟基固定相具有更丰富的表面醇羟基和特异的空间构型,因而其对强极性化合物的保留和分离选择性也有较大的增强。19固定相二、专为HILIC设计的固定相的发展2、醇羟基固定相Alpert,A.J.,J.Chromatogr.1990,499,177–196.20固定相二、专为HILIC设计的固定相的发展2、醇羟基固定相使用β-环糊精固定相分离寡糖,取得了很好的结果,并且从保留值和分离效率两个方面分析了分离原理,认为分离过程中分配作用和氢键作用同时存在。AdvancedSeparationTechnology公司的环糊精固定相Cyclobond2000和CyclobondⅢ以及PolyLC公司的多元醇羟基固定相
本文标题:HILIC
链接地址:https://www.777doc.com/doc-6364071 .html